基于網絡藥理學和分子對接技術探討芪歸藥對調控腫瘤免疫微環境的機制

鄭倩倩，陳璐瑤，何歡，侯夢雪，牛芯蕊，王曉玲，汪濤

（天津中醫藥大學，天津 301617）

據統計，2020年全球新發癌癥病例1 929 萬例，其中中國新發癌癥457 萬人，占全球23.7%，腫瘤的發病率、病死率仍居首位［1］，防控形勢極其嚴峻。隨著對腫瘤發病機制認識的深入，現代醫學對腫瘤的治療從單純殺傷癌細胞逐漸轉向腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME），以TME 為靶標的治療策略與中醫藥診療腫瘤的整體觀相契合。腫瘤免疫微環境（tumor immune microenviroment，TIME）是TME 的重要組成部分，臨床實踐證明，中醫藥在重塑TIME，改善機體的內環境，尤其是使患者可帶瘤生存并防治腫瘤轉移復發方面有獨特的優勢［2］。在對腫瘤病機精準定位的基礎上，諸多學者提出了扶正培本、清熱解毒、活血祛瘀、軟堅散結等治則并積累了許多療效確切的經方、驗方，但因理、法、方、藥流派眾多，復方藥味復雜，不易進行大規模的臨床研究和機制探討，對中醫藥抗癌的有效性和安全性國際認可度偏低。基于中藥成分的多樣性、功能的多靶性，亟待利用網絡數據庫和分子對接技術進行高通量組學數據分析，從系統生物學和生物網絡的角度，闡釋藥物與機體的相互作用，探討抗癌藥對癌細胞生命活動調控相關通路的干預機制［3－4］。故本研究擬運用高通量組學數據分析法，探討芪歸藥對干預TIME的機制，并與陽性對照藥即廣譜免疫調節劑左旋咪唑［5］做對比，以期為以芪歸藥對為核心配伍的中藥復方藥理機制研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選芪歸藥對活性成分并預測主要靶點

應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）在線檢索黃芪、當歸的所有化學成分，設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug－likeness，DL）≥0.18為篩選條件，同時結合相關文獻，篩選出藥對的活性成分并預測每個活性成分的潛在靶點。

1.2 篩選TIME和芪歸藥對交集靶點

在GeneCards 數據庫中以關鍵詞“TIME”檢索，篩選得到TIME 相關基因。利用Ri386 4.0.1 篩選TIME相關基因與藥物的映射靶點。

1.3 構建芪歸藥對－活性成分－靶點－TIME 網絡圖及交集靶點的蛋白互作網（Protein－Protein Interaction，PPI）

將獲取的藥物活性成分、交集靶點等數據導入Cytoscape3.7.1 軟件，構建藥物－活性成分－靶點－疾病網絡，各節點分別代表藥物、活性成分、靶點及疾病，線表示各節點之間的相互關系，利用網絡分析功能得到各節點的度值篩選出核心節點。將交集靶點導入，設置物種為Homo sapiens，置信度0.4，得到蛋白相互作用網絡，并將得到的TSV 文件利用R Studio 4.0.1按度值排列分析。

1.4 芪歸藥對調節TIME 的GO 功能、KEGG 通路富集分析

將潛在的交集靶點輸入David 數據庫中進行GO功能富集分析，選擇生物過程、分子功能和細胞組分3個模塊和KEGG通路富集的分析。GO功能富集分析指在特定功能層次上統計蛋白/基因的數目或組成。KEGG 通路富集分析可用于推斷蛋白質之間新的關聯關系，設定人類基因為篩選范圍，P＜0.05 為篩選值，獲得相應的數據，并用微生信網絡平臺在線工具將得到的芪歸藥對調節TIME 所涉及的相關通路和生物功能數據進行可視化。

1.5 核心成分－靶點分子對接驗證

選取PPI互作圖中度值前5名的靶點，在蛋白質數據庫（protein databank，PDB）下載靶點對應的靶蛋白的3D 結構并進行加氫、去水、去除小分子處理，在PubChem 中搜索芪歸藥對－活性成分－靶點－TIME網絡中連接度排名前3 的小分子，即槲皮素（quercetin）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）及山柰酚（kaempferol）及陽性對照藥左旋咪唑的2D 結構，并使用Chem 3D 軟件進行結構優化，利用AutoDock Vina 軟件進行分子對接，對接結果采用PyMol 2.3軟件進行可視化處理。

2 結果

2.1 篩選芪歸藥對的活性成分及與TIME交集的靶點

通過TCMSP 軟件以藥物標準OB ≥30%和DL ≥0.18 為條件篩選出芪歸藥對18 個有效活性成分，100 個靶標，有效成分的OB 和DL 值見表1。在GeneCards數據庫中與TIME相關的靶標有3 425個，將活性成分的靶標與TIME相關基因進行映射，得到芪歸藥對與TIME 交集靶點79 個，提示黃芪和當歸干預TIME既有獨立的作用靶點，又有共同的協作靶點。

表1 芪歸藥對活性成分的基本信息

2.2 構建芪歸藥對－活性成分－靶點－TIME網絡及PPI圖

藥物－靶點相互作用網絡見圖1、2，藥對中連接度為前3 位的潛在活性分子槲皮素（quercetin）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）及山柰酚（kaempferol）可能通過靶向TIEM 中IL－6、CAPS3、VEGFA、MAPK8、EGFR 等基因發揮作用。

圖1 芪歸藥對活性成分與TIME相互作用圖

2.3 芪歸藥對調節TIME 的KEGG 通路、GO 功能富集分析

將79 個藥物靶點輸入DAVID 數據庫中，以P＜0.05 為篩選條件，KEGG 通路富集78 條，選富集基因數較高的前20條繪制圖表，見圖3A，GO功能富集得到304 條，涉及216 個生物過程、21 個細胞組分、67 個分子功能，每類取富集程度排序最高的前10 繪制圖表，見圖3B。KEGG通路、GO功能富集分析顯示：在缺氧、慢性炎癥的微環境中，microRNA、PI3K/Akt、TNF、MAPK、HIF－1等通路參與調控細胞凋亡、藥物反應及基因表達等生物過程。

圖3 芪歸藥對調節TIME的KEGG通路富集分析、GO分析

2.4 分子對接結果

芪歸藥對活性成分與左旋咪唑分別與圖2B 中選出的度值排名前5 位的關鍵靶蛋白做分子對接，分別見表2、圖4與表3、圖5。藥物活性成分與靶蛋白結合能越低，結合可能性越大，結構越穩定，更易發揮相應的效應。結果提示：藥物活性成分槲皮素可與IL－6（THR－164、GLN－157、SER－108），VEGFA（GLN－20、CYS－10）和EGFR（ARG－71、ARG－80）等分子的氨基酸殘基形成氫鍵，β－谷甾醇可與CASPA3（ASN208）的氨基酸殘基形成氫鍵，山柰酚可與MAPK8（ASP－339、TYR－202、CYS－213、GLY－216、ARG－72）的氨基酸殘基形成氫鍵，與對應的靶蛋白進行良好的結合。左旋咪唑可與VEGFA（SER－11）、MAPK8（GLU－217）、IL－6（GLN－81）的氨基酸殘基結合形成氫鍵并與三者結合，未能與EFGR 與CASP3 形成氫鍵，表明左旋咪唑不能與二者結合。

圖2 交集靶點的PPI圖和靶蛋白的條形圖

圖4 活性成分與核心靶點的分子對接圖

圖5 左旋咪唑與核心靶點的分子對接圖

表2 活性成分與核心靶點的結合能

表3 左旋咪唑與核心靶點的結合能

3 討論

腫瘤類似于“器官樣組織”，由癌細胞、非癌細胞、脈管體系及含多種炎癥免疫因子、代謝物的基質組成。非癌細胞、腫瘤基質構成了癌細胞賴以生存的TME［6］。TIME 是TME 的重要組成部分，在與癌細胞相互作用的動態過程中，免疫細胞在清除和免疫編輯重塑癌細胞的同時，癌細胞及其釋放的瘤源性免疫抑制因子也對免疫細胞進行“反塑型”。癌細胞通過分泌轉化生長因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）、白細胞介素－10（interleukin－10，IL－10）等多種免疫抑制因子及產生外泌體以傳遞miRNA，刺激T 細胞、B 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞向免疫抑制表型的調節性T細 胞（regulatory T cell，Treg）、腫瘤相關巨噬細胞（tumor－associated macrophage，TAMs）、調節性樹突狀細胞轉化，并使髓系免疫抑制細胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）增殖。這些免疫細胞彼此相互作用，表達更多的免疫抑制因子及促瘤生長因子（IL－4、6、10，TGF－β 等），通過抑制細胞毒性T 細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）、NK 細胞的活化，促進CTL、NK 細胞的凋亡，消耗或拮抗IL－2、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）等促炎因子，產生基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等方式促進腫瘤侵襲、血管生成及轉移，形成腫瘤演進和TIME 免疫抑制相互促進的惡性循環［7－8］。

乏氧在某種程度上可視為TIME慢性炎癥、免疫抑制的始動因素。癌細胞的快速增殖、血管畸形造成TIME處于乏氧狀態，各種癌細胞大多過表達缺氧誘導因子（hypoxia－inducible factor，HIF）。HIF－1α 參與70 多個靶基因的轉錄調控，如誘導TGF－β 產生經MAPK、PI3K/Akt 途徑促使癌細胞增殖，上調MMPs 的表達促進腫瘤侵襲轉移，上調VEGF 及其受體的表達促進血管生成，誘導耐藥相關蛋白的表達增加放化療抗性［9］。此外，HIF還通過多種途徑影響免疫細胞的抗癌反應：抑制CD4+T 細胞、CLT、NK 細胞增殖及遷移活性，抑制免疫刺激性細胞因子的產生和釋放；募集Treg，MDSCs、M2 型TAMs 等免疫抑制細胞浸潤，促進它們分泌免疫抑制細胞因子及誘導免疫檢查點分子的表達；改變瘤源性外泌體中miRNA 的成分下調免疫細胞功能［10－11］，逐步促使TIME 形成慢性炎癥、免疫抑制的惡性循環。

中醫學認為，腫瘤是因機體正氣不足，全身氣血陰陽失調、臟腑功能紊亂、津液輸布障礙，痰、瘀、毒等病理產物積聚形成，“正虛”是腫瘤發病的根本原因，“痰、瘀、毒”是腫瘤進展和轉移的必要因素。在腫瘤發展的不同階段，“虛、痰、瘀、毒”常合并出現，TME 存在著免疫抑制（正虛）、血管生成（血瘀）、酸性、高壓、低氧（痰濁）等特點，易誘導癌細胞轉移（癌毒）［12］。據此病機分析，“扶正祛邪、固本培元”是中醫抗癌的基本治則。通過對腫瘤患者的187 張中藥處方調查分析，發現處方中有298 味，排名前5 位的依次是生黃芪、茯苓、砂仁、當歸和炒白術［13］，其中“扶正益氣”中藥黃芪、當歸是常用藥對之一。臨床上曾對120 例腫瘤患者分別給予加味當歸補血湯及調節免疫治療，通過觀察療效、比較免疫學各項指標變化，發現在芪歸藥對為基礎上進行加減能明顯改善患者的免疫功能，使各項免疫指標水平較對照組均明顯上升［14］。“正虛”與腫瘤互為因果，形成惡性循環，以芪歸藥對為基礎配伍的扶正固本方還能促進TIME免疫與血管的正常化，如黃芪補氣湯提取物具有提高小鼠細胞免疫、單核巨噬細胞吞噬能力、NK細胞活性及抗腫瘤的功效［15］；當歸補血湯通過調節VEGF 與VEGFR 和sVEGFR 兩種受體的結合抑制與腫瘤共培養血管內細胞的增殖［16］。

由此，本研究運用關聯規則、聚類算法和網絡藥理學對芪歸藥對調節TIME 的作用機制展開深入分析。KEGG 通路、GO 功能富集分析結果提示，在缺氧、慢性炎 癥的TIME 中，microRNA、PI3K/Akt、TNF、MAPK、HIF－1 等通路參與調控細胞凋亡、藥物反應及基因表達等多種生物過程，而這些通路涉及的生物過程可能是芪歸藥對所含槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇等關鍵活性成分通過干預腫瘤組織IL－6、VEGF、EGFR、CAPS3、MAPK8 的表達發揮抗癌效應的潛在靶點。研究已證實：芪歸藥對的活性成分槲皮素、山柰酚同屬黃酮類化合物，均具有抗炎、抗增殖促凋亡、抗腫瘤等藥理作用，并通過各種途徑切斷TIME 中炎癥－免疫抑制－血管生成之間的正向調控的環路，緩解TIME炎癥免疫抑制惡化程度。槲皮素通過上調TAMs 上的TRAIL－R 表達誘導其凋亡［17］，抑制PI3K/Akt 通路來抑制TIME 慢性炎癥和血管生成，提高荷瘤小鼠存活率［18］，經線粒體凋亡途徑上調Caspse－3、9的表達和阻斷細胞生存相關PI3K/Akt、MAPK/ERK 通路促進人肝癌細胞HepG2 的凋亡［19］。山柰酚能通過下調HIF－1表達，抑制PI3K/Akt 通路或MAPK/ERK 通路的活化降低腫瘤組織VEGF 的表達水平［20］，抑制PI3K/Akt、MAPK 通路下調肝癌細胞表達CDKl、Cyclin B 蛋白，造成G2/M 期阻滯，觸發癌細胞自噬性死亡［21－22］，也可經線粒體凋亡途徑活化Caspase－3、9，上調凋亡相關蛋白Bax/Bcl－2 表達比，并通過抑制細胞周期蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1的表達有效阻止荷瘤鼠膽囊癌的進展［23］。β－谷甾醇屬甾醇化合物，具有免疫調節、抗氧化、抑制炎癥及抗腫瘤等多種生物活性，通過干預Caspase 途徑誘導直腸癌細胞凋亡，通過上調miR－10a 的表達和抑制PI3K/Akt 通路抑制腫瘤生長，顯著減低腫瘤組織MMP－2、9 及VEGF 的表達，抑制癌細胞轉移和侵襲［24］。左旋咪唑（levomisole）是一種廣譜的免疫調節藥物，可以通過增加NK 細胞活性、促進脾淋巴細胞轉化等提高機體的免疫功能［25］，將其作為陽性對照藥可體現出芪歸藥對調節TIME的優勢。

綜上，結合分子對接結果，芪歸藥對的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇可能是通過與TIME密切相關靶蛋白（IL－6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR）的結合發揮作用，與左旋咪唑相比結合能更低，表明這些小分子化合物與左旋咪唑相比具有更好的結合活性，本研究只是利用國內外已有的數據庫進行的分析，是理論的推導。芪歸藥對調節TIME的具體的作用機制還需設計更加完善的實驗進一步研究。