基于TGF－β/Smads通路研究芍藥苷對(duì)慢性盆腔炎大鼠的抗纖維化和抗炎作用

喬文艷，鄧克紅，張娟，楊寶娟

（1.河南省省立醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003；3.焦作市第二人民醫(yī)院，河南 焦作 454001）

盆腔炎（pelvic inflammatory disease，PID）是一種由上行感染引起的女性上生殖系統(tǒng)炎癥性疾病，其特征表現(xiàn)為子宮、子宮頸及附件的炎癥和壓痛，可導(dǎo)致不孕、異位妊娠和慢性盆腔疼痛［1－2］。慢性盆腔炎（chronic pelvic inflammatory disease，CPID）也被稱(chēng)為PID 后遺癥，主要原因?yàn)榛颊呋加蠵ID 但未得到及時(shí)、有效的治療，CPID 患者常有腹痛、腹部墜脹、月經(jīng)異常、腰骶酸痛等癥狀，病理組織檢查可見(jiàn)病灶有慢性的炎癥和纖維化樣改變［3－4］。目前，CPID 以抗生素、激素類(lèi)藥物及手術(shù)治療為主，其治療效果欠佳，因此，尋找新的藥物或療法至關(guān)重要［5－6］。芍藥苷是從芍藥科植物中提取的具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的有效成分，還具有鎮(zhèn)痛、保肝、抗腫瘤、抗抑郁及心臟保護(hù)等藥理學(xué)作用，具有廣闊的應(yīng)用前景［7－8］。芍藥苷也已被證明是治療婦科疾病經(jīng)典方劑——桂枝茯苓方中起主要抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的活性物質(zhì)，但其對(duì)CPID的治療作用仍然不明確，機(jī)制亦有待探討［9］。本研究建立了大鼠CPID 模型，評(píng)價(jià)芍藥苷對(duì)CPID 的治療作用，并探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)SD大鼠，健康未孕雌性，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016－0006。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷（純度≥90%，寧波德康生物制品有限公司，批號(hào)：20200815）；地塞米松片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44024469，規(guī)格：0.75 mg×100 片，批號(hào)：19100232）；HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C0105S）；Masson 三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1340）；實(shí)驗(yàn)所需ELISA 試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）、Smad7、Smad2/3、p－Smad2/3 兔抗［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab215715、ab216428、ab207447、ab272332］；苯酚（上海沃凱化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：100153008）；甘油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20191030）；黃蓍樹(shù)膠粉（上海滬試化工有限公司，批號(hào)：69013261）。

1.3 儀器

HistoCore NANOCUTR 切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；FlexA－200 全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）；HH－S26S 六孔水浴鍋（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；IS－AX 恒溫振蕩器（美國(guó)精騏有限公司）；轉(zhuǎn)印、垂直電泳儀、電泳儀電源及凝膠成像儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組與造模

本研究使用苯酚膠漿法建立CPID 模型，方法參考文獻(xiàn)［10］，取50 只未孕雌鼠麻醉后，于下腹正中作一個(gè)2 cm 的切口，暴露出子宮，從大鼠的左側(cè)子宮向卵巢注入0.1 mL 提前制備好的15%的苯酚膠漿，然后縫合切口并消毒，術(shù)后動(dòng)物按照之前的飼養(yǎng)條件正常喂養(yǎng)。模型建立后依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組，地塞米松組和芍藥苷高、中、低劑量組。另取10 只大鼠為假手術(shù)組，僅在其腹部作一切口，不進(jìn)行藥物注射。

1.4.2 給藥方法

造模10 d后開(kāi)始給藥，地塞米松組大鼠灌胃2 mg/kg地塞米松，芍藥苷低、中、高劑量組大鼠灌胃25、50、100 mg/kg 芍藥苷，所有藥物均用0.5%CMC－Na 進(jìn)行混懸，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積的0.5%CMC－Na，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均每天給藥1次，給藥30 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般情況

治療期間每天對(duì)各組大鼠的精神、活動(dòng)、毛發(fā)、飲食及排泄情況和體質(zhì)量變化進(jìn)行觀察記錄。

1.5.2 ELISA檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1日，所有大鼠禁食12 h，第2 天給藥后2 h 將動(dòng)物麻醉，腹主動(dòng)脈取血，血液置EP 管放入4 ℃冰箱中靜置4 h，移液器吸取上層血清放于－80 ℃中凍存，臨用前解凍，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)血清腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、C－反應(yīng)蛋白－1（C－reactive protein－1，CRP－1）、白細(xì)胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）的含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.3 子宮系數(shù)

取血后處死大鼠，取大鼠子宮組織進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算其子宮系數(shù)。

子宮系數(shù)（%）=子宮組織質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

1.5.4 HE染色

取大鼠子宮組織（左側(cè)），用生理鹽水清洗至無(wú)血絲，分割成大小適宜的組織塊，浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟組織包埋和病理切片的制作。將組織制作成石蠟標(biāo)本后進(jìn)行切片，厚度為5 μm，隨后進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察子宮病變情況。

1.5.5 Masson染色

取“1.5.4”中制備的石蠟組織切片，進(jìn)行常規(guī)Masson 染色，觀察子宮組織中被藍(lán)染的膠原纖維的增生情況。

1.5.6 Western Blot

取適量大鼠子宮組織，置于研磨器中進(jìn)行低溫研磨勻漿，加入RIPA 和PMSF 提取組織蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白作變性處理后進(jìn)行SDS－PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉2 h，4 ℃孵育TGF－β1（1∶1 000）、Smad2/3（1∶1 000）、p∶Smad2/3（1∶800）、Smad7（1∶800）一抗稀釋液，過(guò)夜后洗膜，37 ℃孵育二抗（1∶1 000），再次清洗后滴加發(fā)光試劑，放入凝膠成像儀中成像，使用Image J 軟件對(duì)各個(gè)目的蛋白灰度值進(jìn)行量化，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 25.0 軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況

在造模前后及治療期間，假手術(shù)組大鼠的精神狀態(tài)尚可，毛發(fā)有光澤、整齊，活動(dòng)正常，飲食飲水和排便正常，體質(zhì)量持續(xù)增加。造模后，模型大鼠可見(jiàn)明顯的毛發(fā)枯燥、無(wú)光澤，有脫毛現(xiàn)象，精神倦怠，不喜動(dòng)，進(jìn)食少，陰道分泌物多，尿液色深，糞便形態(tài)黏稠，異味重，體質(zhì)量增加緩慢。經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，造模大鼠的上述表現(xiàn)得到了不同程度改善，體質(zhì)量高于模型組（P＜0.05），以芍藥苷高劑量組的改善最為明顯。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況比較（±s，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況比較（±s，g）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05；與芍藥苷高劑量組比較，▲P＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，○P＜0.05。

給藥第30天304.91±9.76 267.05±6.37*277.51±5.98*#286.20±7.24*#△279.36±6.32*#270.24±7.11*▲○組別假手術(shù)組模型組地塞米松組芍藥苷高劑量組芍藥苷中劑量組芍藥苷低劑量組n 10 10 10 10 10 10造模前248.62±7.87 246.58±6.24 247.35±6.83 248.26±7.90 248.73±6.82 246.94±7.01造模第5天254.47±6.94 235.91±6.65*233.47±7.36*235.82±8.63*234.71±7.15*235.36±7.92*造模第10天268.12±8.36 247.30±7.08*244.85±6.32*245.48±7.21*245.97±7.26*246.21±7.54*給藥第10天275.94±9.77 250.26±6.54*255.98±6.82*256.62±7.81*253.84±7.35*253.72±6.85*給藥第20天287.39±7.59 255.64±7.13*267.13±7.28*#269.42±7.93*#263.84±8.54*#257.92±6.96*

2.2 對(duì)CPID大鼠子宮系數(shù)的影響

模型組大鼠子宮系數(shù)顯著高于假手術(shù)組，各個(gè)治療組大鼠的子宮系數(shù)與模型組比較均有所降低（P＜0.05）。其中，芍藥苷高劑量組和中劑量組大鼠子宮系數(shù)與地塞米松組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），芍藥苷低劑量組子宮系數(shù)高于地塞米松組、芍藥苷高劑量和中劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較（±s，%）

表2 各組大鼠子宮系數(shù)比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05；與芍藥苷高劑量組比較，▲P＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，○P＜0.05。

子宮系數(shù)0.20±0.03 0.35±0.05*0.26±0.03*#0.22±0.04#0.25±0.03*#0.31±0.03*△▲○組別假手術(shù)組模型組地塞米松組芍藥苷高劑量組芍藥苷中劑量組芍藥苷低劑量組n 10 10 10 10 10 10

2.3 對(duì)CPID大鼠血清炎癥因子的影響

模型組大鼠TNF－α、CRP－1、IL－1β、IL－6 的水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05）。各個(gè)治療組大鼠的血清炎癥因子與模型組比較均降低（P＜0.05）。其中，芍藥苷各劑量組的炎癥因子水平高于地塞米松組（P＜0.05）。芍藥苷中劑量組CRP－1、IL－1β 水平高于芍藥苷高劑量組，芍藥苷低劑量組TNF－α、CRP－1、IL－1β、IL－6 水平高于芍藥苷高劑量組（P＜0.05）。芍藥苷低劑量組TNF－α、CRP－1、IL－1β、IL－6 水平高于芍藥苷中劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05；與芍藥苷高劑量組比較，▲P＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，○P＜0.05。

IL－6 15.73±2.13 29.48±3.35*18.02±3.24*#21.32±3.44*#△24.10±2.98*#△28.91±3.02*△▲○組別假手術(shù)組模型組地塞米松組芍藥苷高劑量組芍藥苷中劑量組芍藥苷低劑量組n 10 10 10 10 10 10 TNF－α 184.32±18.20 298.97±32.76*208.28±22.94*#233.36±23.29*#△235.34±24.84*#△263.83±30.01*#△▲○CRP－1 283.34±46.22 664.83±59.97*319.43±48.71*#422.36±53.16*#△521.25±58.72*#△▲597.44±52.96*#△▲○IL－1β 11.09±1.93 19.94±2.10*13.23±1.12*#14.84±1.35*#△16.62±1.19*#△▲17.97±1.34*#△▲○

2.4 對(duì)CPID大鼠子宮病變的影響

染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜和腺體的結(jié)構(gòu)數(shù)量均正常，存在一定量的呈藍(lán)色的膠原纖維，其排列較規(guī)則，結(jié)構(gòu)整齊。CPID 模型大鼠子宮組織層次紊亂，有充血和水腫現(xiàn)象，固有層和肌層的分布不清晰，宮腔可見(jiàn)有明顯縮窄，局部的腔壁增厚、內(nèi)膜缺失，腺體減少，并可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)可見(jiàn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)及肌層形成了大量呈藍(lán)色、形態(tài)紊亂的膠原纖維。各藥物治療組大鼠子宮內(nèi)膜炎性浸潤(rùn)和充血、水腫程度均得到了一定程度的改善，藍(lán)色膠原纖維的沉積量減少。見(jiàn)圖1～2。

圖1 HE染色結(jié)果圖（200×）

2.5 對(duì)CPID大鼠子宮組織TGF－β1、Smad2/3、p－Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，模型組大鼠子宮組織TGF－β1、p－Smad2/3 的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，Smad7 的表達(dá)低于假手術(shù)組。各治療組TGF－β1、p－Smad2/3表達(dá)與模型組比較均降低，Smad7 的表達(dá)均增高（P＜0.05）。其中，芍藥苷高劑量組TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)與地塞米松組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），芍藥苷中劑量和低劑量組TGF－β1、p－Smad2/3 的表達(dá)高于地塞米松組，Smad7 的表達(dá)低于地塞米松組（P＜0.05）。且芍藥苷對(duì)TGF－β1、p－Smad2/3、Smad7 蛋白表達(dá)的影響呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。見(jiàn)圖3和表4。

表4 各組大鼠子宮組織蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組大鼠子宮組織蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05；與芍藥苷高劑量組比較，▲P＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，○P＜0.05。

Smad7 0.94±0.09 0.16±0.04*0.44±0.05*#0.47±0.07*#0.33±0.05*#△▲0.25±0.03*#△▲○組別假手術(shù)組模型組地塞米松組芍藥苷高劑量組芍藥苷中劑量組芍藥苷低劑量組TGF－β1 0.15±0.03 0.98±0.07*0.28±0.04*#0.26±0.03*#0.49±0.05*#△▲0.75±0.06*#△▲○p－Smad2/3 0.23±0.04 1.89±0.09*0.35±0.05*#0.37±0.03*#0.52±0.07*#△▲1.29±0.08*#△▲○

圖2 Masson染色結(jié)果圖（200×）

圖3 Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

3 討論

PID 作為婦科常見(jiàn)病，若未得到及時(shí)治療可發(fā)展為CPID。CPID 難以被治愈，治療后復(fù)發(fā)率較高，患者常伴有生殖器官、腹膜及結(jié)締組織的增生、纖維化、粘連等病變，可導(dǎo)致患者異位妊娠和不孕的發(fā)病率升高，并常伴有疼痛和月經(jīng)異常［11－12］。芍藥主治婦女月經(jīng)不調(diào)、崩漏、血虛腹痛等癥，在臨床應(yīng)用廣泛［13］。芍藥苷是芍藥的主要有效成分，具有多種藥理學(xué)活性，但其對(duì)女性CPID 的治療作用尚不清楚［14］。為了探究芍藥苷對(duì)CPID 的作用，本研究采用苯酚膠漿法建立大鼠CPID 模型，該模型發(fā)病機(jī)制雖與臨床實(shí)際發(fā)病機(jī)制不同，但可造成與CPID相似的臨床表現(xiàn)，易于操作，造模所需時(shí)間較短［15］。結(jié)果顯示，模型組大鼠精神倦怠，不喜動(dòng)，進(jìn)食少，陰道分泌物多且異味重，體質(zhì)量增加緩慢，生存狀態(tài)較差，子宮系數(shù)顯著高于假手術(shù)組，血清炎癥因子（TNF－α、CRP－1、IL－1β 和IL－6）的水平升高，子宮宮腔可見(jiàn)有明顯縮窄，炎癥和纖維化程度明顯，表明CPID模型建立成功。

給予不同劑量芍藥苷治療后，大鼠的生存狀態(tài)得到改善，體質(zhì)量緩慢增加，子宮系數(shù)降低。炎癥反應(yīng)貫穿了CPID整個(gè)發(fā)病過(guò)程，患者始終存在炎性細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)和信號(hào)通路異常轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況，這些反應(yīng)在調(diào)節(jié)CPID炎癥反應(yīng)、組織增生和纖維化的過(guò)程中相互作用，使機(jī)體在CPID疾病發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)度甚至失控的損傷修復(fù)，使細(xì)胞外基質(zhì)的合成過(guò)多，沉積于組織細(xì)胞之間，病理切片檢查往往可見(jiàn)組織纖維化增生明顯，因此，調(diào)節(jié)CPID相關(guān)細(xì)胞因子及信號(hào)通路蛋白表達(dá)平衡是治療CPID 的目標(biāo)［16－17］。在本研究中，使用不同劑量芍藥苷對(duì)CPID大鼠進(jìn)行干預(yù)治療后，大鼠血清炎癥因子（TNF－α、CRP－1、IL－1β 和IL－6）的水平降低，子宮內(nèi)膜的炎性浸潤(rùn)和充血、水腫均得到了一定程度的改善，藍(lán)色膠原纖維的沉積量減少，且其作用呈劑量依賴(lài)性。以上結(jié)果表明，芍藥苷可減輕CPID大鼠的炎癥反應(yīng)，改善CPID相關(guān)的子宮炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織纖維化病變現(xiàn)象。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β1 是TGF－βs 家族中含量和活性均最高的成員，具有強(qiáng)效的促纖維化作用，TGF－β1的水平升高常在發(fā)生不受控制的纖維化反應(yīng)的組織中出現(xiàn)［18］。Smad是參與TGF－β信號(hào)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的蛋白家族，Smad2及Smad3是TGF－β 通路的關(guān)鍵下游蛋白，Smad2 及Smad3 的活化可調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步調(diào)控疾病中的炎癥反應(yīng)和纖維化過(guò)程［19］。Smad7 為Smad 家族的抑制性蛋白，可阻止Smad2 及Smad3 的磷酸化，在TGF－β/Smads 通路中起負(fù)調(diào)節(jié)作用［20］。在本研究中，CPID模型大鼠子宮組織TGF－β1、p－Smad2/3 的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，Smad7 的表達(dá)低于假手術(shù)組。使用不同劑量芍藥苷對(duì)CPID 大鼠進(jìn)行治療后，各個(gè)治療組大鼠子宮組織TGF－β1 蛋白表達(dá)量降低，Smad2/3 磷酸化水平降低，Smad7 的表達(dá)升高，提示芍藥苷可抑制TGF－β/Smads 通路的活化，其抗炎和抗纖維化的作用可能與上述機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，芍藥苷可能通過(guò)抑制TGF－β/Smads通路的活化改善CPID相關(guān)炎性反應(yīng)和纖維化病變，初步揭示了芍藥苷治療CPID 的作用機(jī)制。但CPID 是一種多因素疾病，病機(jī)復(fù)雜，其療效及機(jī)制仍需進(jìn)一步聯(lián)合體外實(shí)驗(yàn)及臨床研究加以闡明。