糖皮質(zhì)激素通過PI3K-Akt-mTOR信號通路誘導(dǎo)股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究

盧非凡 王衛(wèi)國 郭萬首 程立明 張啟棟*

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院骨科-關(guān)節(jié)與骨病外科，廣東 廣州 510000 2.中日友好醫(yī)院骨科一部，免疫炎性疾病北京市重點實驗室，北京 100029

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是骨科常見病和難治性疾病，是指股骨頭血供中斷或受損，引起骨細(xì)胞及骨髓成分死亡及隨后的修復(fù)過程，繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變，股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)功能障礙的疾病，晚期常需關(guān)節(jié)置換，給患者家庭及社會帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1-4]。大劑量糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主要原因，但機制尚未完全明確。不過，股骨頭缺血被一致認(rèn)為是股骨頭壞死的基礎(chǔ)病理改變[5]。股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bone microvascular endothelial cells，BMECs)作為血管中最重要的結(jié)構(gòu)成分，對維護(hù)血管的功能、保障組織正常供血有重要的作用，其損傷是股骨頭循環(huán)功能障礙的重要基礎(chǔ)[6-7]，也是糖皮質(zhì)激素作用的重要部位[8-9]。

PI3K-Akt-mTOR通路是一條促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活的信號通路，對血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性有重要作用，可能在糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的股骨頭壞死發(fā)生中產(chǎn)生重要作用[10-12]。許多研究證實，PI3K-Akt-mTOR通路參與心血管、腎臟等臟器微血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡以及血管形成過程中起著重要的調(diào)控作用[13-14]。本研究擬通過檢測人股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的PI3K-Akt-mTOR通路關(guān)鍵蛋白，分析PI3K-Akt-mTOR通路在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究標(biāo)本來源于中日友好醫(yī)院接受全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療的3例患者，均為女性，平均年齡62.3歲，入院診斷均為新鮮股骨頸骨折，無激素使用史或酗酒史，且排除股骨頭壞死、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病等可能影響骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞的疾病。所有患者均對研究知情同意，并在中日友好醫(yī)院倫理委員會指導(dǎo)下進(jìn)行研究(中日友好醫(yī)院臨床研究倫理審查批號2014-34)。

1.2 標(biāo)本獲取與骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

無菌條件下，取下股骨頭標(biāo)本，去除皮質(zhì)骨及軟組織。在無菌條件下將股骨頭內(nèi)松質(zhì)骨咬成碎骨粒，放入裝有30 mL無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)的50 mL離心管中，立即送至實驗室。將標(biāo)本用手反復(fù)震蕩3～5 min，用DMEM培養(yǎng)基清洗2～3次，去除培養(yǎng)基及上層油脂。向股骨頭組織內(nèi)加入含0.2% Ⅰ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基5 mL，液體量為骨粒體積的4～5倍，37 ℃水浴消化30 min。加入0.25%胰蛋白酶3 mL，使胰蛋白酶終濃度為0.1%。37 ℃水浴消化5 min，用手反復(fù)震蕩。200目細(xì)胞篩過濾，將濾過細(xì)胞的懸液以900 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。棄上層培養(yǎng)液，將細(xì)胞接種在10 mL完全性內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，成分為：M199培養(yǎng)液(美國GIBCO公司)，100 μg/mL鏈霉素(美國Life公司)，100 U/mL青霉素(美國Life公司)，100 μg/mL血管內(nèi)皮生長添加物ECGS Millipore 02-102(義翹神州生物技術(shù)有限公司)，40 U/mL肝素(南京新百藥業(yè)有限公司)，20%胎牛血清(美國GIBCO公司)，含有2%的明膠(提前半小時鋪皿)的直徑10 cm培養(yǎng)皿(美國Thermo Scientific Nunc & Nalgene)內(nèi)。37 ℃ 5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。待細(xì)胞長滿瓶底后，用胰蛋白酶傳代。取第3代骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實驗。

骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定：免疫組織化學(xué)染色鑒定血管性血友病因子(von Willbrand factor，vWF)；血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子/CD-31(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD-31)。

1.3 Western-blot法檢測PI3K-Akt-mTOR通路蛋白表達(dá)的變化

選擇一株上述原代培養(yǎng)的骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)傳代3次后，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氫化可的松(天津金耀藥業(yè)有限公司)處理24 h誘導(dǎo)骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，氫化可的松濃度分別為0.1 mg/mL(低劑量)、0.2 mg/mL(中劑量)和0.3 mg/mL(高劑量)。處理24 h后收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min，800 g在4 ℃離心10 min取上清，測定蛋白濃度后用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，用相應(yīng)第一抗體4 ℃孵育過夜。一抗包括PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR(其中“p”代表磷酸化抗體)(美國Abcam和Cell Signaling Technology)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(北京天德悅生物科技公司)室溫孵育2 h，然后將ECL(美國Millipore)加到膜上反應(yīng)3～5 min，依照不同強度而曝光膠片10 s至5 min，顯影2 min后定影。將蛋白質(zhì)條帶掃描為電腦文件，使用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH的灰度值以校正誤差，分別得到每個樣品不同目的蛋白相對含量。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

選擇一株上述原代培養(yǎng)的骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)傳代3次，加入PI3K抑制劑Wortmannin(美國Selleck)100 nmol/L；培養(yǎng)1 h后分別加入0.1 mg/mL(低劑量)氫化可的松繼續(xù)培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。收獲細(xì)胞后以4 ℃預(yù)冷的流式細(xì)胞液(含2%牛血清白蛋白的PBS)洗細(xì)胞2次制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度至5×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL的Annexin-FITC(eBioscience)和10 μL的20 pg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞液洗3次后再加入500 μL流式細(xì)胞液，流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter)檢測熒光強度，可以將細(xì)胞分為AnnexinV- PI雙陰性的活細(xì)胞、AnnexinV陽性-PI陰性的早期凋亡細(xì)胞、以及AnnexinV-PI雙陽性的晚期凋亡和壞死細(xì)胞。用Coulter的流式分析軟件分析活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡和壞死細(xì)胞比例并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。計數(shù)資料采用卡方檢驗。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，處理采用方差分析、t檢驗等，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

從股骨頭組織中分離培養(yǎng)BMECs并進(jìn)行傳代，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。BMECs傳代培養(yǎng)至第3代，細(xì)胞多呈長梭形、多角形或分枝狀生長(圖1A)。分離的細(xì)胞采用免疫熒光染色，顯示CD31和vWF高表達(dá)(圖1B，1C)。結(jié)果表明成功分離獲得BMECs，可用于后續(xù)實驗。

圖1 骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)A：BMECs提取及細(xì)胞傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至第3代，細(xì)胞多呈長梭形、多角形或分枝狀生長；B：免疫熒光染色標(biāo)記CD-31結(jié)果；C：免疫熒光染色標(biāo)記vWF結(jié)果Fig.1 Morphology and characterization of BMECsA: Cancellous bone in the femoral head was ground into broken bone pieces under sterile condition. BMECs grown to the desired confluence showing a cobblestone morphology. B and C: Immunofluorescence staining results of CD31 and vWF. The representative CD31-positive and vWF-positive cells were identified as BMECs.

2.2 不同劑量氫化可的松對骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR通路蛋白表達(dá)的影響

氫化可的松作用下，通過對數(shù)字化的凝膠電泳條帶灰度值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和Akt蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平同時下降，特別是磷酸化水平明顯下降。與對照組相比，0.1 mg/mL(低劑量)、0.2 mg/mL(中劑量)和0.3 mg/mL(高劑量)3組的p-Akt表達(dá)分別下降60.72%、61.91%、100.00%(P<0.01)。p-PI3K表達(dá)分別下降12.95%、36.26%、100.00%(P<0.01)。p-mTOR表達(dá)分別下降22.95%、41.28%、57.11%(P<0.01)(表1，圖2)。

表1 不同組別骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K-Akt-mTOR通路蛋白表達(dá)結(jié)果Table 1 Expression of protein of PI3K-Akt-mTOR signal pathway in bone microvascular endothelial cells

圖2 關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)因子在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中的變化水平。經(jīng)過0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.3 mg/mL氫化可的松處理24 h后，用Western blot方法檢測PI3K、p-PI3K、Akt、P-Akt、mTOR、p-mTOR等細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)因子的表達(dá)水平。1、2、3、4列分別為正常對照組、0.1 mg/mL低劑量組、0.2 mg/mL中劑量組、0.3 mg/mL高劑量組Fig.2 Changes of key intracellular signal transduction factors in the process of glucocorticoid-induced injury of bone microvascular endothelial cells. After treated with 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, and 0.3 mg/mL of hydrocortisone for 24 hours, the expression levels of PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and p-mTOR were detected with Western blotting. 1, 2, 3 and 4 represented normal control group, 0.1 mg/mL low-dose group, 0.2 mg/mL medium-dose group, and 0.3 mg/mL high-dose group, respectively.

2.3 低劑量氫化可的松對骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

在低劑量氫化可的松條件下驗證糖皮質(zhì)激素對骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。氫化可的松損傷骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞前1 h加入PI3K抑制劑Wortmannin，采用AnnexinV/PI染色的流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡。AnnexinV抗體結(jié)合在早期凋亡細(xì)胞膜，PI可通過破損的細(xì)胞膜結(jié)合在晚期凋亡和壞死細(xì)胞內(nèi)部的核糖核酸。用流式細(xì)胞術(shù)分析PI-AnnexinV染色的細(xì)胞，可以將細(xì)胞分為AnnexinV- PI雙陰性的活細(xì)胞、AnnexinV陽性-PI陰性的早期凋亡細(xì)胞、以及AnnexinV-PI雙陽性的晚期凋亡和壞死細(xì)胞。正常對照的早期凋亡、晚期凋亡/壞死以及活細(xì)胞比例分別為16.08%、30.86%和52.52%；而在低濃度激素?fù)p傷后，早期凋亡上升至21.67%，晚期凋亡/壞死比例上升至37.2%，活細(xì)胞比例下降至39.85%。應(yīng)用Wortmannin抑制PI3K的活化，則糖皮質(zhì)激素?fù)p傷情況下早期凋亡、晚期凋亡/壞死以及活細(xì)胞比例分別為19.05%、37.9%和41.26%。進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，卡方檢驗結(jié)果示χ2=35.05，P<0.001，正常對照組、激素?fù)p傷組和激素?fù)p傷+PI3K抑制劑組組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖3 不同組別骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of bone microvascular endothelial cells

3 討論

本研究結(jié)果表明，PI3K-Akt-mTOR信號傳導(dǎo)通路的3個關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)因子PI3K、Akt、mTOR的表達(dá)水平及磷酸化形式均在氫化可的松作用下受抑制。隨著激素濃度升高，信號通路受抑制表現(xiàn)更為明顯，細(xì)胞凋亡增加。使用Wortmannin抑制PI3K活化可以部分挽救骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞早、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例。這些提示PI3K-Akt-mTOR信號通路參與激素誘導(dǎo)的骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

股骨頭骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為股骨頭血供最重要的結(jié)構(gòu)成分，對維護(hù)血管的功能、保障組織正常供血有重要的作用[15-16]。骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能損害，進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭壞死發(fā)生發(fā)展。(1)激素抑制骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制血管新生。長期大劑量激素使用導(dǎo)致股骨頭微血管密度降低，微循環(huán)交換面積不足，使組織缺血缺氧而發(fā)生激素性股骨頭壞死[17-18]；(2)激素影響骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凝血與抗纖溶。大劑量激素應(yīng)用促進(jìn)凝血活性增高，血管細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞間黏附分子表達(dá)增高，形成微血栓，局部血管閉塞，導(dǎo)致支配區(qū)域缺血壞死[19-20]；(3)激素導(dǎo)致骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損害。大劑量激素上調(diào)與活性氧產(chǎn)生相關(guān)的黃嘌呤氧化酶的表達(dá)，增加活性氧的生成，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[21-22]。

PI3K-Akt-mTOR通路是一條促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活的信號通路，涉及細(xì)胞的增殖、黏附、遷移以及新生血管形成[23-24]。因此，抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路可能是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)股骨頭壞死發(fā)生的重要機制之一。PI3K-Akt-mTOR 信號通路參與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)，在微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡以及血管形成過程中起著重要的調(diào)控作用[10,12-13]。缺血缺氧后，PI3K通路被激活，組織釋放多種細(xì)胞因子對抗缺血損傷，其中促血管新生因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)等大量表達(dá)，誘導(dǎo)骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及血管新生，改善缺血組織的血氧供應(yīng)[25-27]。

PI3K由控制亞基p85和催化亞基p110組成。p85和酪氨酸激酶受體的反應(yīng)導(dǎo)致自身構(gòu)象發(fā)生變化，從而使p110激活，來激活下游的Akt信號。糖皮質(zhì)激素對PI3K-Akt-mTOR信號通路的影響主要體現(xiàn)在p85的表達(dá)受糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoids，GR)活化的調(diào)控。GR在與糖皮質(zhì)激素結(jié)合后活化，進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因結(jié)合，使p85的表達(dá)增高，過量的p85抑制Akt信號的表達(dá)，從而使Akt對成骨細(xì)胞的保護(hù)作用減弱，大量成骨細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致股骨頭壞死的發(fā)生[28]。

Akt是一種典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以促進(jìn)體內(nèi)多種細(xì)胞的生存。Akt被上游PI3K蛋白激活而發(fā)生磷酸化修飾，對各種生物學(xué)刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，從而參與組織細(xì)胞的生長調(diào)控，在調(diào)節(jié)機體細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。激活狀態(tài)的Akt可以抑制細(xì)胞凋亡，活化eNOS，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，進(jìn)而促進(jìn)血管的新生[15,29]。體內(nèi)多種促血管新生因子如VEGF、血管生成蛋白，都是通過Akt發(fā)揮作用的[25-27]。血管內(nèi)皮細(xì)胞在急性低氧后，p-Akt的表達(dá)水平顯著下降[30]。目前研究認(rèn)為Akt通過直接阻止糖原合酶激酶3β活化來保護(hù)細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)不被蛋白酶體降解，并且可以限制細(xì)胞內(nèi)P53蛋白的水平，而P53蛋白和Cyclin D1都是細(xì)胞內(nèi)維持細(xì)胞周期正常進(jìn)行并抑制凋亡的蛋白。Akt通過對P53和Cyclin D1的調(diào)節(jié)，防止了正常細(xì)胞周期的停止，可以有效阻止細(xì)胞凋亡[31]。

mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，整合細(xì)胞內(nèi)外各種信號，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與代謝。生長因子、缺氧、應(yīng)激等細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激通過mTOR及其形成的復(fù)合物調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯、脂類合成、線粒體能量代謝、細(xì)胞生長增殖、自噬、細(xì)胞骨架重組、血管形成等生理過程。免疫抑制藥物雷帕霉素(rapamycin)可特異性地抑制mTORC1。PI3K-Akt-mTOR通路通過調(diào)節(jié)mTORC1上游直接活化因子Rheb的磷酸化狀態(tài)進(jìn)而調(diào)節(jié)mTORC1的活化狀態(tài)。近年來，mTORC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已被證實在骨骼系統(tǒng)發(fā)育及成年后骨代謝平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[32-33]。

本研究的也存在一些不足。首先，本研究只選取低濃度激素組進(jìn)行抑制，為了證實上述實驗結(jié)果，可以增加不同濃度的激素及其相應(yīng)的藥理學(xué)抑制劑，這樣結(jié)果可能更全面。其次，激素性股骨頭壞死的發(fā)病過程中骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞異常只是其中一個環(huán)節(jié)，位于骨組織內(nèi)的骨細(xì)胞以及位于骨組織邊緣的骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞骨對激素性股骨頭壞死也具有病理學(xué)意義，進(jìn)一步深入研究這些細(xì)胞在激素性股骨頭壞死中的變化，可能對于進(jìn)一步明確激素性股骨頭壞死發(fā)生機制更全面。

綜上所述，PI3K-Akt-mTOR信號通路在氫化可的松作用下受抑制。隨著激素濃度升高，信號通路受抑制表現(xiàn)更為明顯，細(xì)胞凋亡增加，提示PI3K-Akt-mTOR信號通路參與激素性股骨頭壞死骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程。