丹參主要活性成分防治骨質疏松癥分子機制研究進展

丁劼 王晗松 王培歌 李小凱 郭海玲 趙詠芳*

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院石氏傷科醫學中心，上海 200120 2.上海市中醫藥研究院骨傷科研究所，上海 200120

骨質疏松癥是一種全身骨代謝性疾病，其主要特征是骨量減少及骨的顯微結構退變，伴骨強度下降、骨脆性增加及骨折危險性增加等。它的基本發病機制是骨重建動態平衡被破壞，成骨細胞與破骨細胞功能失衡，導致骨代謝失衡，骨吸收增多，骨形成減少，最終造成骨吸收遠大于骨形成，骨量丟失[1-3]。中國骨質疏松癥基金會的一項最新研究顯示，我國骨質疏松癥的總患病率為6.6%～19.3%，平均13%，預計到2050年，我國骨質疏松癥或骨密度低的患者將達到2.12億[4]。因此，積極防治骨質疏松癥具有重要意義。

作為我國中醫臨床常用中藥飲片之一，丹參又名紅根、赤參、血參根，是唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根莖。《神農本草經》是丹參最早的文獻記載。丹參性味苦，微寒，歸心、肝經，種植主要分布于我國華北、華東和西北地區。丹參具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效，主要用于治療心腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森病、腎功能不全、肝硬化、腫瘤和骨量丟失等疾病[5-6]。近年來，丹參防治骨質疏松的作用受到廣泛關注，已有大量研究表明其防治骨質疏松癥的作用[7-14]。尤其值得注意的是，丹參可以通過多條信號通路促進成骨細胞的增殖、分化和骨形成，以及抑制破骨細胞的增殖、分化和骨吸收，糾正骨代謝的平衡，從而阻斷骨質疏松癥的發展。丹參的活性成分可分為水溶性成分和脂溶性成分[15]。水溶性成分主要包括丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶酸、原兒茶醛、紫草酸、咖啡酸等；脂溶性成分主要包括二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、丹參酮Ⅵ、隱丹參酮等。為探討丹參在體內抗骨質疏松作用的確切機制，以及為抗骨質疏松新型藥物的研究和開發，本文就近年報道的丹參主要活性成分治療骨質疏松癥的分子信號通路機制作一綜述。

1 丹參活性成分促進骨形成的作用機制

成骨細胞由間充質干細胞分化而來，是蛋白分泌型細胞，能產生Ⅰ型膠原，合成并分泌骨基質，具有高堿性磷酸酶活性，并能吸收和轉運鈣離子，是負責骨形成和骨重建的主要功能細胞[16]。研究[12,17]表明，丹參及其活性成分可促進成骨細胞的增殖、分化和礦化，改善骨小梁的組織結構，促進骨形成。Luo等[18]運用斑馬魚糖皮質激素骨質疏松模型，發現丹參素可以增加成骨細胞分化相關基因Runt相關轉錄因子2a(Runx2a，Runt-related transcription factor 2a)、Osterix、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素(osteocalcin)的表達，從而促進成骨作用，阻止骨質疏松的發生。

1.1 丹參活性成分促進成骨細胞的增殖、分化和礦化作用

1.1.1BMP/Smads信號通路：骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號通路是調節骨骼發育和骨代謝的重要信號通路之一[19]。BMP是轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一個重要成員。其中，BMP-2與相應受體結合后，通過磷酸化激活細胞質的SMAD蛋白，包括SMAD1、SMAD5或SMAD8，隨后這些SMAD蛋白再與SMAD4結合成復合體并轉運入細胞核，從而啟動下游成骨細胞分化相關基因的轉錄和表達。

在糖皮質激素骨質疏松大鼠模型中，丹參素可能通過提高TGF-β的表達改善骨超微結構和促進骨量增加[20]。郭威等[21]研究發現，丹參酮ⅡA能夠提高大鼠體外培養骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)增殖速率，增加BMP-2和成骨細胞成熟相關基因Runx2、ALP、和Ⅰ型膠原(Collagen-1)mRNA的表達水平，并增加骨礦化基質的水平，提示丹參酮ⅡA可能通過增加BMP-2的表達促進BMSCs向成骨細胞分化。Wang等[22]進一步驗證了丹參酮ⅡA可以抑制去卵巢大鼠體外培養骨髓基質細胞的衰老并促進其增殖。而且，丹參酮ⅡA可促進大鼠體外培養成骨細胞的增殖[23-24]，其可能機制是通過上調BMP-2的表達水平[23]。Kim等[25]發現，丹參酮ⅡA能促進BMP-2蛋白誘導間充質前體細胞C2C12的成骨細胞分化能力，而這種促進作用與BMP/Smads/Runx2和BMP/p38 MAPK(絲裂原活化蛋白激酶，mitogen-activated protein kinase)信號通路的激活有關。

1.1.2Wnt/β-catenin信號通路：Wnt/β-catenin通路是調節成骨細胞分化及骨形成中的一條重要信號通路[26]。當Wnt通路活化時，β-catenin蛋白由胞漿轉運入細胞核，進而調控下游成骨細胞分化相關基因的轉錄和表達。閆小飛等[27]研究發現，丹參素可促進原代培養大鼠成骨細胞的分化和礦化作用，且丹參素促進成骨細胞的分化可能與激活Wnt/β-catenin通路有關。

氧化應激激活的轉錄因子叉頭蛋白O3a(Forkhead box O3a，FoxO3a)可以阻斷Wnt通路[28]。Yang等[29-30]研究表明，在間充質前體細胞C2C12和成骨前細胞MC3T3-E1，丹參素通過下調Fox3a轉錄活性抑制氧化應激，從而重啟Wnt通路，激活下游成骨細胞特異性基因Axin2、ALP和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的表達，促進成骨作用。Yang等[31]還發現，在糖皮質激素骨質疏松大鼠模型中，地塞米松會引起大鼠的骨量丟失和一系列骨生物力學指標的下降，而丹參素可以糾正地塞米松的促骨質疏松作用。可能機制是，地塞米松誘導糖皮質激素受體作用基因KLF15(Kruppel-like factor 15)轉錄因子的表達，后者可以通過p66Shc蛋白的磷酸化促進ROS(reactive oxygen species)的增加，從而介導細胞凋亡；而ROS的增加又可以降低Tcf4因子的轉錄活性，進而阻斷Wnt通路抑制下游成骨細胞分化相關基因Runx2、ALP和Osteocalcin的表達。而丹參素可以通過抑制KLF15因子的轉錄活性下調ROS的水平，從而啟動Wnt通路，促進成骨細胞的分化和骨形成作用。

Cui等[32]研究發現，糖皮質激素可以通過提高過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的表達，促進骨髓基質細胞向脂肪細胞的分化，這就意味著向成骨細胞分化的骨髓基質細胞會相應減少[33]，而丹酚酸B可以逆轉這一過程，通過降低PPARγ的表達，減少骨髓基質干細胞向脂肪細胞分化，同時啟動Wnt通路誘導更多骨髓基質細胞向成骨細胞分化，促進骨形成。Yang等[30]和Wang等[34]進一步探索了丹參素和丹酚酸B糾正骨髓基質細胞成骨分化和成脂分化之間紊亂的分子機制，一方面，丹參素和丹酚酸B通過抑制醋酸潑尼松激活的PPARγ2/C-EBPα/ap2(過氧化物酶體增殖物激活受體γ2/CCAAT增強子結合蛋白α/脂肪細胞脂肪酸結合蛋白2)通路，抑制了脂肪的形成；另一方面，丹參素和丹酚酸B重新激活由醋酸潑尼松抑制的Wnt通路，促進了骨的形成。

1.1.3MAPKs信號通路：胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶MAPKs家族的成員，其在骨發育和形成中發揮重要作用[35-36]。Xu等[37]研究發現，丹酚酸B不僅可以增加人胎兒骨髓來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)ALP的表達并促進其礦化作用，而且可以增加MSCs的Runx2、Osterix、骨橋蛋白(Osteopontin)等成骨細胞分化和成熟相關基因的表達，提示丹酚酸B可以促進MSCs向成骨細胞的定向分化和礦化水平。而當加入ERK信號通路阻斷劑U0126或ERK1/2干涉RNA后，丹酚酸B的促分化和礦化作用減弱了，說明丹酚酸B的促MSCs分化和礦化作用是通過激活ERK信號通路實現的。隨后，Wang等[34]進一步在成骨前細胞MC3T3-E1驗證了丹酚酸B這一作用。另一方面，Han等[38]研究發現，在去卵巢大鼠骨質疏松模型中，丹參素可以降低骨轉換率，并且能抑制NF-κB(nuclear factor kappa-B，核因子κB)信號通路的激活，而NF-κB能抑制JNK信號通路的激活[39]，從而促進成骨細胞的分化和成熟。隨后，Zhu等[40]在Wnt1sw/sw骨質疏松小鼠的研究中發現，丹參酮ⅡA也是通過抑制NF-κB信號通路的激活促進成骨細胞的分化和成熟。

1.2 丹參活性成分抑制成骨細胞的凋亡

王秉義等[41]報道，丹參素能夠拮抗醋酸潑尼松誘導氧化應激所致骨質疏松大鼠中成骨細胞的凋亡，并在體外實驗中發現，丹參素能夠上調小鼠成骨前細胞系MC3T3-E1中磷酸化AKT的表達，提示丹參素通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinases/AKT，protein-serine-threonine kinase，PI3K)通路拮抗MC3TC-E1的凋亡。

Li等[42]發現，小鼠成骨前細胞系MC3T3-E1在地塞米松的刺激下Nox4(NADPH oxidase 4，NADPH氧化酶4)依賴的ROS增多，產生氧化應激，從而激活線粒體途徑的凋亡。而丹參酮ⅡA可以通過抑制Nox4的激活，減少氧化應激，從而抑制MC3T3-E1的凋亡。

2 丹參活性成分抑制骨吸收的作用機制

破骨細胞是多核巨細胞，由造血干細胞發育而來，它的分化和成熟主要需要兩大因子：巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)和核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)。M-CSF首先促進破骨細胞前體細胞膜表面表達核因子-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)，而RANK與其配體RANKL的結合通過接頭蛋白腫瘤壞死因子受體相關因子(TNFR-associated factors，TRAF6)激活下游MAPKs、NF-κB和Akt信號通路，從而誘導轉錄因子活化T細胞胞質1核因子(the nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的表達和快速擴增，后者轉移入細胞核，并介導破骨細胞特異性基因的表達，使破骨細胞分化成熟并發揮骨吸收功能[43]。作為RANKL可溶性誘餌受體的骨保護素(osteoprotegerin，OPG)，能與RANK競爭結合RANKL，從而阻斷RANKL介導的破骨細胞分化成熟信號通路。RANKL、RANK和OPG共同調節破骨細胞分化、成熟和生物活性[46]。

張曉燕等[44]研究發現，與去卵巢組相比，丹參素治療組牙槽骨骨量明顯增多，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)陽性的破骨細胞數減少，RANKL/OPG活性比值降低，說明丹參素防治牙槽骨骨質疏松可能與其調控OPG/RANKL/RANK信號通路有關。在炎癥介導的破骨細胞骨吸收中，成骨細胞可以增加環氧化酶2(cyclooxygenase-2，Cox-2)的活性并催化前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的合成，后者通過提升RANKL/OPG活性比例促進破骨細胞的骨吸收作用，導致骨量丟失[45]；而丹參酮ⅡA可以通過抑制Cox-2/PGE2信號通路降低RANKL/OPG活性比例，從而抑制破骨細胞的骨吸收作用[46]。

圖1 丹參活性成分對成骨細胞作用的分子機制示意圖Fig.1 The effect and molecular mechanism on the osteoblasts induced by the active ingredients

Kim等[47]在M-CSF和RANKL誘導體外培養骨髓來源巨噬細胞向破骨細胞分化的試驗中發現，丹參酮ⅡA能在破骨細胞分化過程中下調破骨細胞成熟的標志基因calcitonin受體、c-Src和integrinβ mRNA的表達，并且丹參酮ⅡA是通過抑制RANKL激活的ERK(MAPKs成員之一)、NF-κB和Akt下游信號通路抑制破骨細胞分化成熟；而且丹參酮ⅡA還能通過破壞成熟破骨細胞F-actin環結構抑制其骨吸收作用。Cheng等[48]在RAW264.7細胞系中進一步驗證了丹參酮ⅡA可以通過抑制RANKL激活的ERK、NF-κB和Akt下游信號通路抑制破骨細胞分化成熟。而且，Wang等[49]研究發現隱丹參酮也是通過抑制RANKL介導的ERK磷酸化和NF-κB激活抑制體外培養骨髓來源的巨噬細胞向破骨細胞分化成熟。另外，Nicolin等[50]研究發現，丹參酮Ⅵ通過抑制RANKL/NF-κB通路抑制破骨細胞的分化和F-actin環結構。王麗麗等[51]研究發現，丹酚酸B可能通過抑制NF-κB的活性抑制破骨細胞的骨吸收作用，從而改善高脂飲食小鼠的骨代謝改變。

RANKL與RANK結合之后，通過MAPK信號通路激活轉錄因子AP-1，激活的AP-1與細胞內Ca2+濃度波動共同激活NFATc1分子，NFATc1是調控RANKL介導的破骨細胞分化的重要轉錄因子[43]。Kwak等[52]進一步發現，丹參酮ⅡA通過抑制RANKL介導的c-Fos(轉錄因子AP-1成員之一)和NFATc1表達抑制破骨細胞的分化和成熟。

從以上文獻報道可以看到，丹參不同的活性成分可以干預骨質疏松癥發展的多個靶點、多個通路進行干預(示意圖見圖1和圖2)，其中研究較深入的為丹參素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮Ⅵ，其分子機制總結如下(見表1)。①丹參素通過激活Wnt/β-catenin、JNK和PI3K/AKT信號通路促進成骨細胞的分化和骨形成作用，通過調節KLF15/FoxO3a/Wnt信號通路糾正體內氧化應激狀態，并通過抑制PPARγ2/C-EBPα/ap2信號通路，抑制成骨細胞前體細胞向脂肪細胞的分化，促進成骨作用；而且丹參素可以通過調控OPG/RANKL/RANK 信號通路抑制破骨細胞的分化和骨吸收作用；②丹參酮ⅡA通過激活BMP/Smads、MAPK p38和JNK信號通路促進成骨細胞的分化和骨形成作用，而且丹參酮ⅡA可以通過調控RANKL/RANK及其下游ERK、NF-κB和AP-1信號通路抑制破骨細胞的分化和骨吸收作用；③丹酚酸B通過激活Wnt/β-catenin和ERK信號通路促進成骨細胞的分化和骨形成作用，并通過抑制PPARγ2的表達，抑制成骨細胞前體細胞向脂肪細胞的分化；而且丹酚酸B通過抑制NF-κB/cathepsin K信號通路抑制破骨細胞的骨吸收作用；④隱丹參酮和丹參酮Ⅵ通過調控RANKL/RANK 及其下游的NF-κB信號通路抑制破骨細胞的分化和骨吸收作用。丹參的許多活性成分與現代抗骨質疏松化學藥物具有相似的藥理作用，而且天然藥物丹參中提取的活性成分不良反應小，各活性成分的優化配比最大程度地發揮了藥效，這為將來對抗骨質疏松新型藥物的研究和開發提供了更多思路。

圖2 丹參活性成分對破骨細胞作用的分子機制示意圖Fig.2 The effect and molecular mechanism on the osteoclasts induced by the active ingredients derived from SM

表1 丹參各活性成分干預成骨細胞和破骨細胞的信號通路