青娥丸治療絕經后骨質疏松癥的作用機制

孫坤坤 韓學超 孫娜 康壽明 徐琬梨

山東中醫藥大學，山東 濟南 250355

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于絕經后女性卵巢功能衰退進而雌激素水平下降，從而導致骨吸收大于骨形成，出現低骨量和骨組織的顯微結構退行性變，骨脆性和骨折易感性增加的一種全身代謝性疾病[1]，由PMOP引起的嚴重的醫療和社會負擔已成為全球性公共衛生問題。中醫方劑青娥丸為補腎強腰的代表方劑，臨床療效突出，但具體作用機制不明確，本研究綜合總結了近年來青娥丸治療PMOP的臨床應用、活性成分和現代藥理機制，為研究該方治療PMOP的療效和機制提供了現代科學依據。在文獻研究的基礎上借助網絡藥理學的方法探討青娥丸治療PMOP的潛在作用機制，為青娥丸治療PMOP臨床應用提供新的思路。

1 青娥丸中主要中藥活性成分藥理研究

1.1 杜仲

杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，《神農本草經》言其“主腰脊痛，補中益精氣，堅筋骨”。即具有補肝腎，強筋骨的功效。在中藥綜合數據庫(TCMSP)中共發現172種化合物，包括杜仲苷、松脂醇二葡萄糖苷、黃酮類等化合物。在現代中藥研究與藥理學研究中發現杜仲中桃葉珊瑚、槲皮素和京尼平苷在小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 體外培養中可促進成骨細胞的增殖與分化[2]；另有研究[3]顯示，咖啡酸、京尼平苷酸、黃芩苷和紫云英苷作為杜仲抗骨質疏松的活性成分能夠提高成骨細胞分化，而且京尼平苷酸還可以抑制成骨細胞向破骨細胞轉換，維持細胞動態平衡。此外，趙亮等[4]通過鹽炙杜仲治療去卵巢骨質疏松大鼠發現杜仲可以改善血清骨轉換指標，促進成骨細胞分化，加速骨形成從而治療PMOP。

1.2 補骨脂

補骨脂為豆科植物補骨脂的干燥成熟果實，具有補腎助陽的功效，可治療腎陽不足引起的腰膝疼痛，同時在治療PMOP中療效突出。近年來隨著對補骨脂的研究不斷深入，已從補骨脂中分離出近百種化合物，主要包括香豆素類、黃酮類、單萜酚類。補骨脂素與異補骨脂素是補骨脂的主要活性成分，兩者都具有雌激素樣作用，可作用于雌激素受體提高成骨細胞的分化與增殖，增加骨保護素的表達，抑制破骨細胞的成熟與分化，從而減少骨質損失[5-6]。另有文獻研究[7]發現，補骨脂素不僅能通過激活 NF-κB 有絲分裂原刺激成骨細胞增殖，而且能增加卵巢切除骨質疏松大鼠模型的骨量，此外，補骨脂中的補骨脂酚除了能促進成骨細胞的增殖與分化外，還能提高骨質疏松患者的骨密度促進正常骨骼發育鈣化。

2 青娥丸在絕經后骨質疏松癥治療中的臨床應用

青娥丸契合PMOP發病病機，在PMOP治療上療效顯著，近年來對于青娥丸治療PMOP的臨床研究日益增多。夏雪等[8]通過臨床觀察發現青娥丸能明顯改善PMOP患者臨床癥狀，減輕患者疼痛，增加骨密度，臨床用藥安全可靠、療效確切，可以有效防治PMOP。余海等[9]通過臨床研究報道青娥丸通過抑制破骨細胞活性來改善骨質疏松，抑制骨吸收，降低骨橋蛋白水平，并可以長期維持PMOP患者的骨密度，有效防治PMOP。陸思成等[10]對60例腎陽虛型PMOP患者臨床觀察，結果顯示青娥丸可明顯改善癥狀，增強骨質強度，減少骨折的發生。陳帆等[11]通過對國內外治療PMOP文獻進行Meta分析顯示，青娥丸的治療效果優于西藥常規治療，能明顯緩解PMOP患者疼痛。另有多項臨床研究[12-13]報道了青娥丸對于治療腎虛血瘀型PMOP具有良好療效，可以明顯改善患者腰背疼痛和腰膝酸軟的癥狀，增加骨密度，提高患者生活質量。

3 青娥丸治療絕經后骨質疏松癥的藥理機制

為了更好地了解青娥丸治療PMOP的作用機制，近年來在其藥理機制方面研究增多。動物實驗[14]表明，青娥丸有效改善PMOP大鼠異常骨代謝，防止骨量流失。細胞實驗[15-16]證實，青娥丸含藥血清均能夠顯著提高人成骨細胞活性，從而刺激骨形成，抑制骨量流失，改善骨代謝，發揮防治PMOP的作用。

骨微循環與PMOP密切相關，骨量的減少總是伴隨著骨微血管在骨髓腔中的低灌注而發生，實驗研究[17]證實青娥丸能提高大鼠股骨骨髓灌注參數以及血管內皮標志物血小板-內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)、血管內皮生長因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)表達水平從而改善骨微循環治療PMOP。TNF-α、IL-6是骨代謝過程中最常見且最重要的炎癥細胞因子，在介導PMOP患者骨吸收中發揮重要作用，有研究[18]指出青娥丸通過抑制TNF-α、IL-6的水平而抑制破骨細胞的增殖和分化，發揮治療PMOP的作用。

絕經后女性體內雌激素水平明顯下降，低水平的雌激素會抑制Wnt/β-catenin信號通路表達，從而影響骨代謝。β-catenin作為該信號通路中最關鍵的分子之一，能夠調節破骨細胞分化、增值和凋亡，同時β-catenin的過表達可增加Wnt信號的活性[19]。此外，有研究[20]發現β-catenin水平與RANKL/OPG比值呈顯著的負相關，RANKL/OPG比值增大引起骨代謝負平衡，在骨代謝系統中RANKL可誘導破骨細胞進一步分化、加速骨吸收；OPG一方面競爭性結合RANK，另一方面促進骨形成、抑制骨吸收。實驗研究[21]發現青娥丸能夠顯著提高患者血清β-catenin蛋白表達水平，進而恢復RANKL-RANK-OPG軸紊亂，減少骨量流失，提高患者骨密度從而有效發揮防治PMOP的作用。此外，研究發現青娥丸能提高血清中雌激素的水平，細胞實驗研究[22]表明雌激素可以提高細胞內抗氧化酶的表達，降低細胞內活性氧ROS水平，改善細胞的氧化應激損傷發揮抗PMOP的作用。

4 青娥丸活性化合物在治療絕經后骨質疏松癥中的作用

中藥復方不是藥物的單純組合，而是多種有效成分的協同作用，為了解青娥丸的多組分治療系統如何對PMOP產生多重效應，我們采用綜合網絡藥理學方法分析青娥丸和PMOP中活性生物標志物的共同靶標。構建這種方法是為了揭示青娥丸、靶蛋白和PMOP的活性標志物之間的關系(圖1)。

圖1 青娥丸治療PMOP系統藥理學框架Fig.1 pharmacological framework of Qing’e pill in the treatment of PMOP system

經過分析統計，除去沒有靶標的化合物，在青娥丸中共找尋到37個化合物，其中杜仲30個、補骨脂5個、核桃仁2個、大蒜1個，將所有化合物靶標去重后得到218個藥物靶標。在DisGENET數據庫中發現PMOP疾病靶標171，由于疾病靶標過少，我們將171個靶標映射到高質量蛋白組學數據庫HINT(High-quality INTeractomes)中，HINT數據庫[23]整合了8個蛋白-蛋白相互作用數據庫HPRD、BioGrid、VisAnt、DIP、MIPS、IntAct、IRefWeb、MINT并通過高質量篩選標準保留可靠性中高的數據，最后得到PMOP靶標1 776個。本研究將青娥丸與PMOP靶標取交集，最終獲得79個活性靶蛋白用于后續分析。整理“藥物-成分-靶標”的相互對應關系，并將其導入Cytoscape3.6.0軟件中，構建青娥丸治療PMOP的網絡藥理圖(圖2)。

圖2 青娥丸組方活性成分-靶點網絡圖Fig.2 Active component-target network diagram of Qing’e Pill prescription

對網絡進行拓撲結構分析，取Degree值前20個節點，其中成分12個，靶點8個。杜仲成分槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、丁香黃素(Syringetin)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)、(9R)-6′-甲氧基奎寧-9-胺三鹽酸鹽、三甲花翠苷(hirsutin_qt)、丙烯醇、咖啡酸(caffeic acid)，補骨脂成分豆甾醇(stigmasterol)，核桃仁成分鞣花酸(ellagic acid)，核桃仁和大蒜共有成分亞麻酸(linolenic acid)，可能通過作用于HSP90AA1、NCOA2、ADRB2、DPP4、AR、NOS2、ESR1、RXRA等關鍵蛋白干預了多個成骨、破骨、骨微循環等相關生物學過程，從而發揮對PMOP的治療作用。其中杜仲的相關成分槲皮素、山奈酚等與PMOP相關作用靶點連接密度較大，因此杜仲可以成為青娥丸治療PMOP的關鍵藥物。由此可見，青娥丸網絡中既存在一個化合物與多個靶蛋白的相互作用，也存在不同化合物作用于同一個靶標的現象，表明了青娥丸的多成分、多靶標、多通路的作用特點，初步闡釋了青娥丸補腎強骨的藥效物質基礎和作用機制。

對青娥丸與PMOP共有的79個靶標進行KEGG分析，從生物信號通路角度構建“交集靶標-信號通路”對應的網絡關系圖(圖3)，篩選出15條重要信號通路，節點大小表示富集到靶標的數量，紅色節點越大表示信號通路的顯著性越高，說明該條信號通路的重要性越高。筆者推測青娥丸治療PMOP的作用機制可能與TNF信號通路(TNF signaling pathway)、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)等多條信號通路有關。此外筆者使用Cytoscape軟件中cytoHubba插件對79個關鍵蛋白進行分析，找尋關鍵蛋白與重要活性化合物進行分子對接驗證，對接結果如圖4所示。

圖3 關鍵通路-核心靶標圖Fig.3 Critical pathway-core target diagram

圖4 關鍵蛋白-重要活性化合物分子對接圖Fig.4 Key protein-important active compound molecular docking diagram

5 結論與展望

青娥丸作為中醫經典方劑治療PMOP療效顯著。本文從成分、臨床和實驗研究、藥理作用等方面系統綜述了青娥丸對PMOP的影響，經KEGG通路富集分析與分子對接驗證推測青娥丸在PMOP治療中有一定作用，青娥丸起源于宋代，到如今已廣泛應用于治療PMOP。然而青娥丸的開發仍存在一些挑戰，如缺乏毒理研究及更進一步系統的活性成分研究，所以導致青娥丸中有些活性化合物可能被忽略。但是，生物信息學、網絡藥理學、高通量測序、高效液相色譜等現代科學技術將越來越有助于青娥丸治療PMOP的機制研究。因此，在青娥丸等中藥復方防治PMOP的研究工作中，筆者將繼續運用先進的方法與手段探討其有效成分與作用機制，堅持中西醫并重，為深入研發治療PMOP的中藥復方新藥奠定基礎。