基因c06orf223通過PI3K/AKT/mTOR信號轉導促進大腸癌進展的分子機制研究

焦璐 熊鷹

我國大腸癌的發病率和病死率均保持上升趨勢。2015中國癌癥統計數據顯示，我國結大腸癌發病率、病死率在全部惡性腫瘤中均位居第5位，其中新發病例37.6萬，死亡病例19.1萬[1]。雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K/AKT通路下游的一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其有整合細胞外多種信號刺激的作用，在體內參與多條信號通路的傳導[2]，其mTOR與細胞的生長以及凋亡等存在密切的關系。基因c06orf223與多種腫瘤的轉移存在密切的相關性，c06orf223基因的高表達與腫瘤細胞的增殖、侵襲以及遷移的形成相關[3,4]。PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)通過肌醇脂質磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2]的磷酸化，形成第二信使分子磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸[PI(3,4,5)P3]，其招募并激活包含pleckstrin同源結構域的蛋白質，導致下游信號事件對細胞凋亡至關重要擴散、生存和移徙。Akt亞型有一個N端PH(pleckstrin homology)結構域和一個激酶結構域，這兩個結構域由39個氨基酸的鉸鏈區分開。有催化活性的Akt調節多種底物的功能，這些底物參與細胞的存活、生長、增殖、代謝和蛋白質合成，其是細胞存活的關鍵介質，其失活與各種應激誘導的病理性細胞死亡和退行性疾病有關。PI3K/AKT/mTOR信號通路在細胞周期進程、細胞生長、存活、肌動蛋白重排和遷移以及細胞內囊泡轉運等生物學過程中起著重要作用。本研究通過選取24例新鮮的大腸癌組織，從而探究基因c06orf223通過PI3K/AKT/mTOR信號轉導促進大腸癌進展的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年1月至2020年9月于我院進行手術切除的24例新鮮的大腸癌組織及其癌旁組織(全層腸壁)，其中選擇的癌旁組織距離癌組織約10 cm。患者中有男12例，女12例；年齡平均(46.82±5.42)歲；TNM分期均為Ⅲ～Ⅳ期57例。患者在手術切除前未做化療和放療治療。實驗所需的正常人腸上皮細胞系FHC均購自美國ScienCell研究實驗室。大腸癌組織組(n=24)、癌旁組(n=24)、正常人腸上皮細胞組(n=24)，其中大腸癌組織組又分為空白對照組(n=12)和抑制組(n=12)，其中空白對照組不抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路。抑制組則加入AKT抑制劑Honokiol。AKT抑制劑Honokiol濃度為100 μg/ml，與細胞數的比例是1∶0.01 μg/ml。

1.2 方法 收集的組織標本用無菌PBS洗滌，迅速放置于液氮冷凍，然后放在-80℃保存。將購買的細胞復蘇后置于含有100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素、10%體積的胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃，5.0%的CO2的細胞培養箱中培養，以備后續實驗。

1.2.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路在組織和細胞中激活情況的比較:采集患者大腸癌組織及其癌旁組織各5 g，研磨后3 000 r/min的條件下離心處理10 min，取上清液5 ml，Western blot檢測蛋白的表達水平；提取總RNA并進行RT-PCR，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳50 min，紫外燈下用凝膠成像系統成像，用UVI圖像分析處理系統進行吸光度掃描，以目的基因片段/GAPDH片段的條帶灰度值比值來表示mTOR、PI3K與AKT mRNA相對含量。

1.2.2 過表達c06orf223促進PI3K/AKT/mTOR信號激活比較:取培養細胞轉染過表達的c06orf223質粒，添加到培養基中，將細胞添加到上述培養基中，輕微晃動培養板，放置于培養箱中培養。按照1.2.1方法測定mTOR、PI3K與AKT蛋白和mRNA的相對含量。

1.2.3 下調c06orf223抑制PI3K/AKT/mTOR信號激活的比較:取培養細胞轉染的c06orf223 siRNA質粒，添加到培養基中，將細胞添加到上述培養基中，輕微晃動培養板，放置于培養箱中培養。按照1.2.1方法測定mTOR、PI3K與AKT蛋白和mRNA的相對含量。

1.2.4 抑制PI3K/AKT/mTOR信號降低大腸癌細胞増殖能力的比較:將對數生長期的培養細胞加入96孔細胞培養板中，同時添加100 μl的細胞培養液和AKT抑制劑，將96孔板置于37℃，5.0%的CO2培養箱中培養，當培養時長達到0、24、48、72 h時取出細胞培養板。然后在每孔中添加10 μl的MTT溶液，于37℃環境中反應4 h。取上清溶液并添加150 μl的DMSO溶液，孵育10 min。在470 nm波長下測定OD值，OD值越大則表示細胞的增殖能力越強。

1.2.5 抑制PI3K/AKT/mTOR信號降低大腸癌細胞侵襲能力的比較:細胞侵襲能力通過Transwell小室進行測定。取100 μl濃度為3×105個/ml的培養細胞添加到Transwell小室上室中，于下室中添加500 μl的含血清的培養基和AKT抑制劑。分別在培養0、24、48、72 h后用濃度為4.0%的多聚甲醛溶液固定細胞20 min，通過結晶紫溶液染色20 min。于放大倍數為400的顯微鏡下觀察細胞的侵襲數目。

2 結果

2.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路在組織和細胞中激活情況比較 3組PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白表達情況比較，正常腸細胞系最高，大腸癌組織最低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1、2。

表1 PI3K/AKT/mTOR信號通路在組織和細胞中激活情況比較

圖1 組織和細胞中PI3K/AKT/mTOR通路mRNA表達

2.2 過表達c06orf223促進PI3K/AKT/mTOR信號激活的比較 大腸癌細胞中轉染c06orf223，Western blot檢測檢測細胞中PI3K/AKT/mTOR信號相關蛋白表達變化。結果發現，過表達大腸癌細胞中的PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平較大腸癌細胞升高(P<0.05)。見表2。

圖2 組織和細胞中PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達

表2 過表達c06orf223促進PI3K/AKT/mTOR信號激活比較

2.3 下調c06orf223抑制PI3K/AKT/mTOR信號激活比較 大腸癌細胞中轉染下調c06orf223，Western blot檢測檢測細胞中PI3K/AKT/mTOR信號相關蛋白表達變化。結果發現，下調基因大腸癌細胞中的PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平較大腸癌細胞降低(P<0.05)。見表3。

表3 下調c06orf223抑制PI3K/AKT/mTOR信號激活比較

2.4 抑制PI3K/AKT/mTOR信號大腸癌細胞増殖能力比較 大腸癌細胞經過1 μm的AKT信號抑制劑處理以后，經Transwell小室檢測抑制組細胞増殖能力較空白對照組下降(P<0.05)。見表4。

表4 抑制PI3K/AKT/mTOR信號大腸癌細胞増殖能力比較

2.5 抑制PI3K/AKT/mTOR信號大腸癌細胞侵襲能力比較 大腸癌細胞經過1 μm的AKT信號抑制劑處理以后，經Transwell小室檢測抑制組細胞侵襲數目較空白對照組降低(P<0.05)。見表5。

表5 抑制PI3K/AKT/mTOR信號大腸癌細胞侵襲能力比較

3 討論

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國發病率和病死率均呈上升趨勢[5-7]。我國最常見的是大腸癌其發病率目前占到了消化道癌癥總發病率的85%，臨床上主要表現為便秘、腹瀉和便血等癥狀，嚴重者可及機生命[8-10]。磷脂酰肌醇3激酶(P13K)是一種位于胞質的脂質激酶；AKT，又稱蛋白激酶B，作為PI3K下游的一個重要的靶激酶，其是c-AKT表達編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[11]。mTOR可以通過AKT發生直接或者間接的磷酸化反應，從而激活，磷酸化mTOR則不僅能夠通過上調細胞周期素加速細胞周期，同時還可以通過清除泛素蛋白抑制自噬的發生[12]。基因c06orf223是近年來發現的與大腸癌發生發展存在相關行的基因，屬于鼠源性基因啟動子的轉錄抑制因子，該基因間接調控著PI3K/AKT/mTOR信號通路，最終抑制細胞的增殖以及侵襲能力[13]。本研究結果顯示，過表達的c06orf223基因會促進PI3K/AKT/mTOR信號激活，而通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號會降低大腸癌細胞侵襲和增殖能力。基因c06orf223可以通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路降低大腸癌細胞的増殖和侵襲能力。

本研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路對大腸癌細胞的增殖和侵襲能力的形成至關重要，PI3KAkt信號通路會引發一系列的癌細胞的相關變化。PI3KAkt信號通路與Wnt/β-catenin信號通路存在較大的聯系，因為Wnt/β-catenin信號通路是大腸癌細胞增殖和分化過程中重要的信號通路，該通路功能的強弱程度與癌細胞的形成量的多少有關[14]。當AKT的T308和Ser473位點被3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和mTORC2激活并磷酸化后，AKT便能夠立即從胞質內轉移到細胞膜上，進而被活化成P-AKT，而活化后的P-AKT蛋白能夠再次通過調控多種細胞轉錄因子，從而發揮自身的作用，例如能夠促進細胞的增殖和抵抗細胞凋亡現象的發生，同時還能促進細胞的侵襲轉移等生物學作用[15]。磷酸化的AKT復合體可激活mTORC1，mTORC1磷酸化后又可激活其直接作用底物磷酸化核糖體蛋白S6激酶和真核生物始動因子4E結合蛋白1，進行下一級聯反應，控制細胞翻譯、核糖體生物合成、代謝等重要的生理功能。

腫瘤的發生發展是由于不同的基因在不同時期的表達以及功能出現紊亂而引起的復雜的病理性過程。許多促癌基因、抑癌基因以及與癌癥發展存在相關性的基因的激活或者異常失活均是腫瘤發生的基礎。因此，在研究腫瘤通路方面尋找新的相關基因對于闡明腫瘤的發病機制以及診斷、預防和治療均有重要意義。有研究發現了AKT與c06orf223可能相互作用的證據并且其功能上可能與c06orf223協同，表明c06orf223可能為調控AKT的表達的重要[16-18]。并且通過研究與c06orf223直接和間接作用的蛋白所在信號通路，預測出c06orf223可能參與的PI3K/AKT/mTOR信號通路，且與大腸癌的發生發展密切相關[19,20]。

綜上所述，基因c06orf223能夠通過降低大腸癌細胞侵襲和增殖能力，進而緩解大腸癌的發生發展，其機制可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路有關。而相關的基因功能序列以及作用靶位點仍有待進一步研究。