SM22α基因啟動子區(qū)高甲基化與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

趙芳 宋玉霞 孟煒 孟桐羽 周莎莎 王雪娟 郭樺

上皮性卵巢癌(EOC)是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤其病死率居于婦科惡性腫瘤首位[1]。卵巢癌發(fā)病十分隱匿，患者早期多無典型臨床癥狀，約70%的患者明確診斷時(shí)已是晚期[1]。卵巢癌極易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以根除，且術(shù)后易復(fù)發(fā)，目前晚期卵巢癌患者5年生存率仍在30%左右[2]。因此，進(jìn)一步探討卵巢癌的發(fā)生及卵巢癌細(xì)胞如何擴(kuò)散至遠(yuǎn)處器官的分子機(jī)制，對其預(yù)防、早期診斷及綜合治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。平滑肌蛋白22α(SM22α)是一種腫瘤抑制因子。研究表明SM22α在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，如：乳腺癌[3]、肺癌[4]、大腸癌[5]等。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中SM22α的表達(dá)水平也顯著低于正常卵巢組織。然而其表達(dá)降低的調(diào)控機(jī)制尚不清楚?；蚣谆诮M織特異性基因表達(dá)調(diào)控方面起重要作用，通過影響轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄[6]。本研究將應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)的方法檢測SM22α基因在卵巢癌組織中的甲基化狀態(tài)，探討SM22α基因啟動子的甲基化與其mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性及其與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例組收集2015年12月至2019年10月期間于我院初治行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的上皮性巢癌患者51例經(jīng)術(shù)后病理確診為上皮性卵巢癌，且所有患者術(shù)前均未行新輔助化療。患者年齡28～73歲，平均年齡(53.5±6.4)歲。腫瘤分化程度：高、中分化27例、低分化24例；組織學(xué)類型：漿液性腺癌35例、子宮內(nèi)膜樣癌10例、黏液性囊腺癌6例； FIGO 手術(shù)病理分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期4例、Ⅲ期33例、Ⅳ期5例；淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移：陽性16例，陰性35例。對照組收集同期因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級或早期宮頸癌行全子宮雙附件切除的55例患者的卵巢組織，術(shù)后病理證實(shí)為正常卵巢組織。對照組年齡32～69歲，平均年齡(52.1±8.2)歲。病例組和對照組患者年齡匹配，統(tǒng)計(jì)分析無差異(P>0.05)。所有標(biāo)本均在離體后迅速收集，并迅速轉(zhuǎn)入-80℃冰箱存放。病例資料收集及標(biāo)本采集均經(jīng)過患者本人知情并簽署同意書，本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑與儀器 PCR反應(yīng)試劑盒和DNA提取試劑盒購買于美國Qiagen公司；亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold)購買于美國Zymo Research公司；TRIzol試劑盒購買于北京索萊寶公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于美國Promega公司；Go Taq Green Master Mix試劑盒購買于上海凱杰；7500型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法

1.3.1 組織DNA提取及甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)：卵巢癌和正常卵巢組織DNA應(yīng)用DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，其濃度及純度使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。應(yīng)用亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold)將每個(gè)樣本的DNA(500 ng)進(jìn)行修飾。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)SM22α基因啟動子區(qū)甲基化、和非甲基化兩對引物。PCR的反應(yīng)體系為20 μl：亞硫酸氫鹽修飾的DNA 1 μl、引物(上游引物、下游引物)各0.5 μl、Mix液 10 μl、最后添加去離子水至20 μl。PCR反應(yīng)條件設(shè)定：95℃預(yù)變性5 min； 95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，成像并判讀結(jié)果。結(jié)果判定：SM22α基因啟動子區(qū)甲基化引物擴(kuò)增出條帶，SM22α基因啟動子區(qū)非甲基化引物未擴(kuò)增出條帶，為SM22α基因啟動子區(qū)完全甲基化；相反，SM22α基因啟動子區(qū)甲基化引物未擴(kuò)增出條帶，SM22α基因啟動子區(qū)非甲基化引物擴(kuò)增出條帶，為SM22α基因啟動子區(qū)甲基化陰性；SM22α基因啟動子區(qū)甲基化和非甲基化引物均擴(kuò)增出條帶，為部分甲基化，也記為SM22α基因啟動子區(qū)完全甲基化陽性。

1.3.2 總RNA提取及qRT-PCR反應(yīng)：卵巢癌及正常卵巢組織總RNA應(yīng)用TRIzol試劑按照說明書操作進(jìn)行抽提，應(yīng)用Nanodrop2000測定其含量和純度。應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，放置于-20℃保存?zhèn)溆谩PCR擴(kuò)增檢測SM22α目的基因 mRNA的水平，反應(yīng)體系為：Green Master Mix 10.0 μl、上游引物各 1.4 μl、cDNA 模板1.0 μl、Rox 0.1 μl、去離子水 6.1 μl。qPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)；最后95℃變性15 s、60℃退火60 s、95℃延伸30 s。SM22α基因mRNA在各樣本中的相對表達(dá)量采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算獲得。見表1。

表1 MSP及qRT-PCR的引物序列

2 結(jié)果

2.1 SM22α基因在卵巢癌和正常卵巢組織中的甲基化狀態(tài) 利用MSP檢測了SM22α基因啟動子區(qū)在51例卵巢癌組織及55例正常卵巢組織中的甲基化情況，結(jié)果顯示：卵巢癌組織中甲基化狀態(tài)陽性有31例(60.8%)，甲基化狀態(tài)呈陰性為20例(39.2%)；正常卵巢組織中甲基化狀態(tài)陽性有12例(21.8%)，甲基化狀態(tài)陰性有43例(78.2%)。2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.67，P<0.05)。見表2。

表2 2組SM22α基因甲基化狀態(tài)比較 例(%)

2.2 卵巢癌和正常卵巢組織中SM22α mRNA的表達(dá)情況 qRT-PCR結(jié)果顯示：卵巢癌組織中SM22α mRNA的相對表達(dá)量為0.73 ± 0.22，顯著低于其在正常卵巢組織中的表達(dá)(1.49±0.52)，2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.554，P<0.05)。見表3。

表3 2組SM22α基因mRNA表達(dá)比較

2.3 SM22α基因甲基化狀態(tài)與其mRNA表達(dá)的關(guān)系 SM22α甲基化陽性卵巢癌組織中其mRNA相對表達(dá)量為(0.66±0.18)，SM22α甲基化陰性卵巢癌組織中其mRNA相對表達(dá)量為(0.83±0.24)。t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示：甲基化陽性組織中SM22α mRNA的表達(dá)水平顯著低于其在甲基化陰性組織中的表達(dá)(t=-2.751，P<0.05)。見表4。

表4 病例組中不同甲基化SM22α mRNA相對表達(dá)量比較

2.4 SM22α甲基化及表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 SM22α在卵巢癌組織中甲基化狀態(tài)和SM22α在卵巢癌組織中mRNA的表達(dá)水平與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與年齡、病理類型、分級、手術(shù)殘余病灶等不相關(guān)(P>0.05)。見表5。

表5 SM22α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

3 討論

卵巢癌是女性生殖道系統(tǒng)致死率最高的惡性腫瘤，具有生長迅速、侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生盆腹腔內(nèi)種植播散等生物學(xué)特征。盡管近些年對卵巢癌的綜合治療取得較大進(jìn)展，早期卵巢癌患者的5年生存率可達(dá)到80%～90%，但晚期患者5年生存率仍為30%～40%[7]。因此，尋找用于卵巢癌的早期篩查、診斷與預(yù)后評估等的生物標(biāo)志物，同時(shí)尋找對卵巢癌新的治療分子靶點(diǎn)，對于臨床治療卵巢癌及改善患者預(yù)后具有重要意義。

細(xì)胞骨架在細(xì)胞的生命活動如細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中起重要作用，其結(jié)構(gòu)或功能的異常改變可能是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要因素。SM22α作為一種actin結(jié)合蛋白，可通過與細(xì)胞骨架肌動蛋白結(jié)合來參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和表型分化維持方面起重要作用[8]。SM22α不利于細(xì)胞的侵襲和遷移是通過增加actin的堅(jiān)固性，從而防止細(xì)胞去極化來實(shí)現(xiàn)的。有報(bào)道顯示，SM22α在多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)呈顯著降低狀態(tài)，如：乳腺癌[3]、肺癌[4]、大腸癌[5]等。Li等[9]發(fā)現(xiàn)SM22α在大腸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常癌旁組織，表達(dá)下調(diào)的SM22α可增加癌細(xì)胞的增殖能力及侵襲能力，并減少癌細(xì)胞的凋亡；Nair等[10]報(bào)道了SM22α表達(dá)降低可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。這些結(jié)果均表明SM22α可能是一種新型的抑癌基因。然而目前筆者尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外有SM22α與卵巢癌相關(guān)的 報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)與正常卵巢組織相比，SM22α在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著降低低于，且SM22α的表達(dá)量與卵巢癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，應(yīng)用qRT-PCR檢測了卵巢癌組織及正常卵巢組織中SM22α的表達(dá)，并分析SM22α表達(dá)量與患者臨床病理特征的關(guān)系。本研究結(jié)果同樣顯示卵巢癌組織中SM22α的表達(dá)低于正常卵巢組織，這提示表達(dá)下調(diào)的SM22α可能在卵巢癌變過程中起作用。與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性相比，SM22α在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明 SM22α表達(dá)可能與細(xì)胞的侵襲和遷移相關(guān)。通過擴(kuò)大樣本量，本研究發(fā)現(xiàn)SM22α表達(dá)水平也與卵巢癌患者的FIGO分期相關(guān)，SM22α在Ⅲ、Ⅳ期患者中的表達(dá)水平顯著低于Ⅰ、Ⅱ期患者。臨床分期是判斷患者預(yù)后的重要因素，因此SM22α的表達(dá)水平有可能作為判斷卵巢癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

DNA甲基化是真核細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控的主要方式之一，在胚胎發(fā)育、組織分化、腫瘤發(fā)生及其他復(fù)雜疾病中發(fā)揮重要作用。先前的研究表明SM22α在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)主要由甲基化狀態(tài)來調(diào)控[11]。此外，Zhao等[12]應(yīng)用去甲基化試劑處理大腸癌細(xì)胞株HT29后，SM22α基因表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步表明SM22α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)可調(diào)控SM22α的表達(dá)。

為了明確卵巢癌組織中SM22α表達(dá)下調(diào)是否由甲基化調(diào)控，本研究進(jìn)一步檢測了SM22α基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。與正常卵巢組織相比，SM22α基因啟動子區(qū)在卵巢癌組織中的甲基化陽性率顯著增加(P<0.05)，且甲基化水平與卵巢癌患者FIGO分期、淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。此外，SM22α在甲基化陽性癌組織中mRNA的表達(dá)水平與甲基化陰性組織相比，顯著下調(diào)。這些結(jié)果與Sayar等[13]的結(jié)果相似，該研究報(bào)道了SM22α基因啟動子區(qū)在乳腺癌組織中呈高甲基化狀態(tài)，且其甲基化狀態(tài)與SM22α的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)性。我們的結(jié)果表明卵巢癌組織中SM22α基因啟動子區(qū)的高甲基化可能通過下調(diào)SM22α來增加癌細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[14-17]。

綜上所述，卵巢癌組織中SM22α的甲基化陽性率顯著升高，SM22α mRNA表達(dá)水平則顯著降低，且與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，表明SM22α基因啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下降可能在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。進(jìn)一步深入研究SM22α的作用機(jī)制，有望為卵巢癌診斷和治療提供新的重要靶點(diǎn)。