人乳頭瘤病毒基因亞型在尖銳濕疣患者及疑似患者中流行情況研究

陳 晨，朱琴芳，徐紅星

（南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，江蘇 蘇州 215002）

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種嗜人體組織細胞的DNA病毒，可廣泛感染人類皮膚、生殖道組織，引發(fā)增生性疾病，如尖銳濕疣（Condyloma acuminatum，CA），尖銳濕疣又稱生殖器疣或病毒疣，近年來其發(fā)病率有上升趨勢［1］。目前可分離200多種HPV基因亞型，與人類常見疾病相關的有30多種亞型，不同型別的HPV致病能力差異較大，依據(jù)HPV引起的增生性病變是否致癌，將其分為低危型和高危型，包括低危亞型6、11、42、43、44等，高 危 亞 型16、18、31、33、39、45、51、52、56、58型等［2］。為了解本地區(qū)尖銳濕疣感染年齡、性別、基因亞型等分布情況，筆者應用流式熒光雜交技術，就383例本院皮膚科就診的尖銳濕疣患者及疑似患者進行HPV-DNA基因亞型檢測，包括低危亞型HPV6、11、40、42、43、44、55、61、81、83十種型別，高危亞型HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82十七種型別，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料 尖銳濕疣患者及疑似患者383例來自本院皮膚科2018年8月1日至2020年1月30日的就診患者，其中男性217例，女性166例，年齡（16～70）歲，平均年齡（33.1±10.7）歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 暴露疣體的疑似尖銳濕疣患者，行常規(guī)消毒，用無菌鑷子摘取疣體組織，存放于專用保存液送檢。其余患者，女性用無菌棉拭子擦去宮頸口的分泌物，用宮頸刷旋轉4至5圈收集脫落細胞，或用無菌棉拭子于相應皮損部位反復摩擦后取出放入保存液送檢；男性患者，也用無菌棉拭子于相應皮損部位反復摩擦，置保存液送檢。

1.2.2 主要試劑和儀器

1.2.2.1 試劑 上海浩源生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑，上海透景生命科技股份有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑（流式熒光雜交法）。

1.2.2.2 儀器 PerkinElmer Pre-NAT全自動核酸檢測反應體系構建系統(tǒng)，ABI-Veriti基因擴增儀，多功能流式點陣儀Luminex200。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 核酸提取 采用Pre-NAT全自動核酸檢測反應體系構建系統(tǒng)應用磁珠法進行樣本核酸提取。高濃度胍鹽將細胞或病毒蛋白外殼裂解，釋放出核酸，游離的核酸吸附到磁珠顆粒表面，洗滌去除溶液中的雜質，最后將核酸從磁珠上洗脫下來，作為下游實驗用模板。

1.2.3.2 流式熒光雜交方法 原理：采用通用引物多重PCR擴增，流式熒光雜交分型檢測的方法，同時檢測27種HPV DNA。試劑盒共設置了2類探針和28顆分類微球，其中，與HPV DNA雜交的探針包被在27個分類微球上，對應型別特異性探針的信號為陽性將被判定為該型別HPV陽性，質控微球是與人β球蛋白（β-globin）基因雜交的探針，它的結果提示取樣、提取模板、PCR擴增和雜交整個過程是否符合要求。首先PCR擴增待檢測樣本DNA，得到的PCR產(chǎn)物與微球上交聯(lián)的探針根據(jù)堿基互補配對原理雜交，微球上相應探針捕獲到標有生物素（Biotin）的PCR產(chǎn)物，加入標記了鏈霉親和素（SA）的藻紅蛋白（PE）后，形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-Biotin-SA-PE復合物，最后在多功能流式點陣儀上檢測熒光信號。擴增與雜交參數(shù)：擴增體系為：10μl反應液，5μl引物，0.8μl聚合酶，5μl模板；擴增條件為：95℃ 5min、95℃ 30s、58℃ 30s、68℃ 30s擴 增5個 循 環(huán)，95℃ 30s、55℃ 30s、68℃30s擴增30個循環(huán)；雜交條件為：3μl擴增產(chǎn)物加22μl微球混勻，95℃ 5min、48℃ 30min，加75μlLSA-PE、48℃ 15min。

結果判斷：如果PCR產(chǎn)物和探針完全配對，則在流式點陣儀上即可檢測到分類微球的熒光信號，信號大于等于150，結果判斷為陽性；如果PCR產(chǎn)物和探針不配對，則分類微球的熒光信號為背景信號，檢測結果為陰性。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 尖銳濕疣患者及疑似患者年齡和性別構成 （21～30）歲年齡段就診患者人數(shù)最多，占總人數(shù)的44.9%，其次為（31～40）歲年齡段，占30.8%，最少為＞60歲年齡段，占3.1%。就診患者男性多于女性，分別占56.7%、43.3 %，男性和女性就診人數(shù)均為（21～30）歲年齡段最多，分別占男女人數(shù)的45.2%、44.6%。＞60歲年齡段就診患者以男性為主，占該年齡段男女人數(shù)83.3%，其次為（41～50）歲，占78.4%，≤20歲年齡段就診患者以女性為主，占70%。具體結果見表1。

表1 383例就診患者各年齡段性別構成

2.2 HPV總體感染及各年齡段男女患者感染率 383例就診患者HPV陽性277例，陽性率為72.3%，其中男性感染158例，感染率為72.8%，女性119例，感染率71.7%，男女感染率差異不顯著（χ2=0.059，P=0.807）。感染人群主要為（21～30）歲和（31～40）歲年齡段人群，感染率分別為68.6%和71.2%，（41～50）年齡段男性感染率明顯高于女性，除該年齡段外其余年齡段感染性別差異不明顯（χ2=6.286，P=0.179），男性最高感染率年齡段為＞60歲，該年齡段男性100%陽性，女性感染率最高年齡段為（51～60）歲和＞60歲，均為100%陽性。具體結果見表2。

表2 277例HPV感染患者不同性別各年齡段感染率

2.3 就診患者感染類型 多重亞型高于單一亞型感染率，分別為37.6%和34.7%，不同年齡段單一感染與多重感染存在差異（χ2=16.679，P=0.005），二重以上亞型高達18.0%；低危亞型和高低危亞型混合感染為感染主要類型，兩者感染率（29.5%和26.6%）高于高危亞型（16.2%），低危亞型及高危亞型均以單一亞型感染為主（23.5%與11.2%）。具體結果見表3和4 。

表3 277例HPV感染患者亞型數(shù)量與年齡段分布

2.4 檢測結果亞型 低危亞型HPV6和11為主要型別。低危型感染陽性率排前五的是HPV6、11、81、43、55，依次為28.2%、17.0%、8.4%、5.5%、4.7%；高危型感染陽性率排前的是HPV16/52、58、51/68，依次為7.8%、7.0%、5.7%。HPV6多重略多于單一感染例數(shù)（58 vs 50），HPV11多重感染則明顯多于單一感染例數(shù)（43 vs 22），其余各亞型也均為多重多于單一感染。從年齡結構分析各亞型，總體上分布在（21～30）歲，其次是（31-40）歲年齡段。具體結果見表5。

表5 277例HPV感染患者檢測結果亞型

3 討論

尖銳濕疣是臨床常見的生殖器疾病，主要傳播途徑是性傳播，常以亞臨床感染形式存在，隱匿性、傳染性強、復發(fā)率高，是由人乳頭瘤病毒HPV引起的增生性疾病［3-4］。HPV是直徑為50-55nm DNA病毒，具有高度的宿主專一性，由雙鏈DNA構成，包括7900個核苷酸，所有HPV病毒的基因組結構相似，嚴格條件下進行雜交可確定病毒亞型。研究表明，HPV基因型的分布和流行存在明顯的種族和地區(qū)差異，某種型別在特定區(qū)域占主導地位［5-7］。因此，了解本地區(qū)尖銳濕疣患者及疑似患者中HPV感染的年齡、型別等對流行病學調查具有重要意義。

表4 277例HPV感染患者高危與低危型感染情況

門診就診尖銳濕疣患者及疑似患者的年齡和性別分布情況分析表明，就診患者在（21～30）歲年齡段為峰值（44.9%），隨年齡增長而呈下降趨勢（除外20歲及以下年齡段患者），與阮建波等結果一致［8］。就診患者性別為男性多于女性，就各年齡段男女比例分析，基本為隨年齡增加男性患者比例增加，60歲年齡段達83.3%；女性患者隨年齡增加而減少，20歲及以下患者有70%為女性，應引起足夠重視。有關就診患者男女比例問題，未見有文獻報道。

本次研究中，對總體感染率及各年齡段及男女各自的感染率進行了分析，結果表明，總體感染率男性與女性（72.8% vs 71.7%）經(jīng)統(tǒng)計學分析無顯著性差異。最高感染年齡段為（21～30）歲、（31～40）歲，合計感染率為72.9%，即以青年人為主要感染人群，與王穩(wěn)等報道（21～30）歲檢出數(shù)最多一致［9］。50歲以上的高年齡患者盡管就診患者數(shù)少（36例），但共有35例陽性患者，該年齡段的感染率高達97.2%，即高年齡就診患者一旦接觸病毒，就有極高感染風險，可能與其免疫功能差有一定相關［10-11］。對該類人群，應做好宣傳，避免直接或間接接觸。

分析本組患者的單一和多重感染結果表明，277例感染者中，多重感染比例高于單一感染比例（52.0% vs 48.0%）。馬貴濤［12］等報道，女性尖銳濕疣患者HPV單一感染60.51%多于多重感染39.49%，可能與單純分析女性人群有關。同時，多重感染中二重感染比例與三重及以上感染比例基本各占一半，最多高達七重感染，分析其原因，可能尖銳濕疣患者因復發(fā)而導致不同亞型的感染。文獻報道，尖銳濕疣患者存在細胞免疫功能異常，導致HPV發(fā)生免疫逃逸，從而引起反復感染［13-15］。從低危和高危亞型感染分析，本研究結果中，尖銳濕疣患者的感染以單純低危和高低危混合感染為主，分別占HPV感染患者感染類型的40.8%和36.8%，剩余22.4%為單純高危亞型感染，說明HPV低危亞型是尖銳濕疣患者的主要病原體［16］，但相當一部份人群單純感染高危亞型，故針對尖銳濕疣患者，應進行HPV高低危分型檢測，而不能僅檢測HPV低危亞型。

文獻報道，女性宮頸HPV亞型感染存在地域差異［17-20］。本文感染亞型結果分析顯示，HPV6、HPV11是尖銳濕疣感染的主要型別，其次是HPV81、HPV16、HPV52。大連王穩(wěn)等報道感染亞型前五依次為HPV11、HPV6、HPV16、HPV52、HPV53/58，廣東馬貴濤［12］等報道主要感染型別依次為HPV11、HPV6、HPV43、HPV16、HPV52/58，與本文結果有區(qū)別，故尖銳濕疣患者HPV感染存在地域差異，包括主要感染型別不同、陽性率不同及感染年齡段差異。