櫻桃果園生草對土壤微生態的影響

趙柏霞，閆建芳，潘鳳榮

(1.大連市農業科學研究院，遼寧 大連 116036；2.大連民族大學，遼寧 大連 116600)

【研究意義】大連市依托其得天獨厚的地理位置和氣候條件，作為中國為數不多甜櫻桃(Cerasusavium)適栽區之一，栽培歷史悠久。近年來，在櫻桃栽培面積迅速增加，產業規模不斷擴大的同時，果園土壤肥力下降、水土流失等問題也逐漸顯現出來[1]。果園生草栽培在19世紀始于西方發達國家，近些年，在諸多發達國家已經得到了廣泛的運用，據報道，55%～70%的果園都采用了生草栽培模式，有的國家甚至達到95%左右。我國從20世紀80、90年代才開始推行果園生草模式，目前的普及率僅有10%左右[2-3]。果園生草具有改善土壤的物理性狀、降低土壤容重[4-5]、增加土壤滲水性和持水能力[6-7]、提高土壤肥力[8-10]、調節果樹根系周圍的溫濕度等作用[11-12]。【前人研究進展】近年來，我國科研工作者在果園生草方面做了大量的工作，主要集中在蘋果園、橘園、梨園等，研究方向主要是果園土壤理化性質和土壤肥力[13-15]、微生物群落變化[16-17]、果實品質[18-19]、草種選擇[20-21]、葉片特性[22-23]等方面。目前，關于在櫻桃果園進行生草栽培研究則較少，李芳東等[24]研究發現，甜櫻桃果園生草可以降低0～30 cm土壤日最高溫度和晝夜溫差，增大土壤含水量，谷巖[8]研究發現，甜櫻桃園間作紫花苜蓿可以有效提高土壤有效養分含量，增加團粒結構，使土壤肥力顯著提高。但是，甜櫻桃果園行間生草對土壤微生物群落動態的影響鮮有報道。【本研究切入點】本試驗在甜櫻桃果園行間種植鼠茅草(Vulpiamyuros)、黑麥草(Loliumperenne)、鋪設園藝地布，并以清耕為對照，開展不同處理方式對土壤養分和細菌群落特性影響的研究。【擬解決的關鍵問題】探明甜櫻桃果園生草后土壤養分結構和細菌群落結構的變化，篩選出適宜種植的生草品種，以期為甜櫻桃果園生草栽培奠定基礎，為構建合理的甜櫻桃果園土壤管理模式提供理論依據，推動果園種植業的綠色健康發展。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗櫻桃園位于遼寧省大連市甘井子區大連農科院櫻桃園，該園地位于121° E，39° N，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，年平均氣溫10 ℃，年降雨量550～800 mm，無霜期180～200 d，年平均日照時數2500～2800 h。地塊平整，土壤為砂壤土。2013年建園，株行距3.0 m×4.0 m。

1.2 試驗設計

2018年9月開始播種試驗，采取果樹行間種草，條播種植。果樹株行距為4 m×3 m，試驗設種植鼠茅草(S)、種植黑麥草(H)、鋪設園藝地布(D)和清耕對照(Q)4個處理，每個處理設3次重復，每個處理小區面積為100 m2，共12個處理小區。各處理管理措施基本一致，常規管理。

1.3 土壤溫濕度測定

試驗與2020年4—7月進行，使用土壤溫濕度記錄儀(型號為T2S-2X，浙江托普云科技有限公司生產)測定土壤的溫度、水分。分別在4月和7月兩次測定土壤的溫濕度。

1.4 樣品采集

2020年6月下旬在各處理小區按5點法采集土壤樣品，清除表層凋落物后，采集取5～15 cm 土層土樣，帶回實驗室，將每個處理的土樣充分混勻、去除根系等雜質后分成2份，1份干冰保存用于微生物群落測定，另一份自然風干，過60目篩后用于土壤理化性質測定。

1.5 土壤理化性質測定

采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測定有機質含量，采用凱氏定氮法測定土壤全氮含量，采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定有效磷含量，采用醋酸銨浸提—原子吸收分光光度計(火焰)法測定速效鉀含量[25]。

1.6 土壤微生物多樣性測定

1.6.1 測序處理 此部分試驗由北京百邁客生物科技有限公司完成。采用DNA提取試劑盒PowerSoil?DNA Isolation kit提取土壤樣品基因組DNA。以此為模板，根據16S 全長引物27F 和1492R，合成帶有Barcode 的特異引物，進行PCR 擴增。PCR產物根據電泳結果用ImageJ軟件)定量，經過混樣、純化后使用PacBio 測序平臺進行測序。

1.6.2 信息分析處理 對原始數據中導出 CCS 序列，進行 Barcode 識別，長度過濾，去除嵌合體，得到 Optimization-CCS；將 Optimization-CCS 序列進行聚類，將97%一致的序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，并根據OTU的序列組成得到其物種分類。基于OTU分析結果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析和Alpha多樣性指數分析；使用QIIME軟件進行 Beta 多樣性(Beta diversity)分析，通過NMDS分析、樣品聚類熱圖及樣品PCA、PCoA圖比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。并通過組間差異顯著性分析在不同組間尋找具有統計學差異的 Biomarker。

2 結果與分析

2.1 不同生草處理對土壤溫濕度日變化的影響

在春季，與清耕相比，生草及覆蓋地布對土壤溫度、濕度都有一定的增加作用。生草區域的土壤溫濕度均高于清耕對照，土壤最高溫分別增加15.4% 和23.2%，土壤最高濕度分別增加24.1% 和23.9%。鼠茅草和黑麥草對土壤增溫的效應相差不多。種植鼠茅草和黑麥草區域土層達到最高溫的時間滯后于清耕對照區2～4 h(圖1)。

圖1 生草對土壤溫濕度的影響(春季)

在夏季，生草和覆蓋地布處理則都降低了土壤溫度(圖2)，提高了土壤濕度，降溫提濕效果順序為鼠茅草>黑麥草>地布。種植鼠茅草區域的土壤最高溫度比對照降低了5.9%，土壤濕度則比對照提高了43.7%。究其原因可能是由于生草和覆蓋阻擋了土壤與外界之間的能量交換，阻擋了水分的蒸發，因而影響了土壤的溫濕度。

圖2 生草對土壤溫濕度的影響(夏季)

2.2 不同生草處理對土壤理化性質的影響

由表1可以看出，生草和鋪設園藝地布處理后的pH均有所提高，其中鼠茅草和黑麥草處理的pH顯著高于清耕對照和地布覆蓋。生草處理的土壤養分含量高于地布覆蓋和清耕處理，土壤的全氮、速效鉀、有效磷以及有機質含量與清耕相比差異顯著，但是鼠茅草、黑麥草處理的土壤養分含量沒有明顯差異。全氮和有效磷含量中，園藝地布處理均低于清耕對照。可見，生草栽培能在一定程度上提高櫻桃果園土壤的有機質、氮、磷、鉀含量。而鋪設園藝地布提高速效鉀、有機質的含量，降低土壤中全氮、有效磷的含量。

表1 不同處理對土壤理化性質的影響

2.3 生草對土壤微生物群落的影響

2.3.1 多樣性指數和OTU豐度 4組樣品測序后通過Barcode識別，共獲得223 507條CCS序列(Circular Consensus Sequencing)，通過長度過濾、去除嵌合體后獲得219 858條有效序列，鼠茅草、黑麥草、園藝地布及清耕的有效序列分別為12 506、9686、12 213和9565。使用Mothur軟件，對樣品Alpha多樣性指數進行評估(表2)。所有序列按97%的相似度進行OTU分類，共得到2203個OTUs，其中鼠茅草OTUs數目最高，其次是園藝地布，清耕處理的OTUs數目最低。Shanon、Chao 1及ACE指數呈現出相似的變化趨勢，即，鼠茅草>黑麥草>清耕>園藝地布，說明鼠茅草處理的樣品中細菌的多樣性和豐富度最高，其次是黑麥草，園藝地布處理的最低。

表2 各組樣品OTU數目及多樣性指數

由圖3 可看出，各處理的稀釋曲線末端基本趨于平緩，表明測序基本飽和，說明取樣基本合理，能夠較為真實地體現樣品的微生物群落結構組成。盡管會忽略樣品中某些含量較少的微生物群落，但樣品中主要優勢的微生物均已得到分析。

圖3 土壤樣品的稀釋曲線

2.3.2 不同生草處理土壤細菌類群組成 本研究獲得的微生物序列可分21個門，39個綱，85個目，119個科，221個屬，263個種。基于OTU分析結果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析，獲得各樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學水平上的群落結構圖。如圖4所示，在已分類的門中，變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetota)、放線菌門(Actinobacteria)的豐度較高。各樣品中細菌門類組成基本一致，其中變形菌門是各個處理樣品中最優勢的類群。黑麥草樣地中變形菌門相對豐度最高，為39.64%，鼠茅草、園藝地布及清耕樣地中分別為29.21%、32.78%及34.08%。酸桿菌門在鼠茅草樣地中相對豐度最高，為19.64%，其他3個樣地中豐度差異不明顯。

圖4 4個處理土壤細菌在門、屬水平的分布

對屬水平豐度分析發現，鼠茅草樣地中Vicinamibacter屬和Brevitalea屬相對豐度最高，分別為8.89%、5.46%；這2個屬在黑麥草樣地中豐度分別為6.49%、3.27%，在園藝地布樣地中豐度為5.56%、2.92%；在清耕樣地中豐度為6.33%、4.18%。在清耕樣地中Sphingomonas屬的豐度為4.83%，是4組樣品中最高的，而鼠茅草樣地中Sphingomonas屬豐度僅為1.83%。以上結果顯示，在細菌不同分類等級水平上，鼠茅草處理與其他3個處理樣地均呈現出了較大的差異。

2.3.3 不同生草處理間細菌群落關系 用非度量多維標定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling，NMDS)對各處理所包含的物種信息進行分析，基于OTU水平的NMDS分析結果(圖5)顯示，Q和 D組中的點較分散，說明取樣時造成了重復之間的誤差，但是脅強系數為0.1262，說明該NMDS分析具有一定的可靠性，可以解釋各樣品中的細菌群落結構。代表鼠茅草和黑麥草樣品的點距離較近，說明這兩組樣品中所含的細菌群落較相似，與園藝地布覆蓋和清耕樣地里的所含的細菌群落差異較大。

圖5 各樣品的NMDS分析圖

為了進一步分析尋找各組樣品之間具有統計學差異的物種，對供試樣品進行了Line Discriminant Analysis Effect Size(LEfSe)分析(圖6)。在鼠茅草樣品中豐度顯著高于清耕樣品的細菌主要是Acidobacteria門細菌，主要是Vicinamibacteraceae、Vicinamibacter、Silvestris。而清耕樣品中Sphingomonas、Sphingomonadaceae、Sphingomonadales、Alphaproteobacteria 細菌則顯著高于鼠茅草樣品。

圖6 各樣品細菌差異LEfSe分析

另外，對黑麥草和清耕樣品進行LEfSe比較分析發現，Gammaproteobacteria綱中Burkholderiales 目細菌豐度明顯高于清耕樣品。鼠茅草和黑麥草樣品對比，鼠茅草樣品中Actinobacteria的細菌豐度具有顯著優勢，而黑麥草樣品中Gammaproteobacteria綱樣品則豐度較高。

由此可見，櫻桃果園內生草能明顯改變土壤中細菌群落和優勢種群。而這些細菌種群的變化，則會在一定程度上影響果園土壤的理化性質。

3 討 論

果園生草后可以調節果園溫濕度、改善土壤理化性質，在行間生草后，改變了果園小氣候環境，土壤和近地層的光、熱、水、氣等生態因子都發生了一定的變化，形成了有利于果樹生長發育的微域下氣候環境，為果樹生長發育創造良好的環境條件。而對于果園微環境具體的影響程度則取決于生草的種類。本研究以種植鼠茅草、黑麥草、鋪設園藝地布以及清耕的櫻桃果園土壤為研究對象，研究了不同處理情況下土壤溫濕度、理化性質變化情況。結果表明，櫻桃果園生草區域在春季提高了土壤溫濕度，而在夏季，生草處理則降低了土壤溫度，提高了土壤濕度。這一結果與相關學者的報道相一致，李國懷等[26]和梅立新等[27]研究發現生草具有提高土壤含水量、調節地溫的作用。李祥彬[28]研究發現蜜柚果園人工種草后，改善了土壤的團粒結構，增加了土壤的滲水性和持水能力，進而增加了土壤含水量。通過果園生草可以避免因溫度過高影響果實生長和日灼，還可以避免因為溫度過低造成果樹凍害、抽條、霜凍等。

土壤pH是土壤的酸堿度，可以影響土壤性質和肥力，進而直接或間接影響植物的生長。在本試驗中，土壤pH為弱酸性，生草可以提高土壤的pH，蔣小軍[29]、黃毅斌[30]、段舜山[31]等的研究結果為生草能夠提高南方酸性土壤的pH，這個結果與本文的試驗結果相一致，都是提高了酸性土壤的pH。而朱先波等[32]研究發現，黑麥草可以降低獼猴桃果園堿性土壤的pH，安建軍[33]研究報道，在大櫻桃果園種植10種草種，均降低了堿性土壤的pH，綜上結果說明果園生草可以調節土壤的酸堿度，使其向pH中性方向發展。

氮、磷、鉀是果樹生長發育必須的營養元素，也是土壤肥力的物質基礎，其含量及存在狀態，影響著果樹的生長發育、產量和果實品質。在本試驗中，各生草處理區與清耕對照區相比，生草栽培能在一定程度上提高櫻桃果園土壤的有機質、氮、磷、鉀含量，鼠茅草和黑麥草的效果差異不顯著。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成成分，它在調節土壤養分循環和能量流方面發揮著重要作用。本文通過高通量測序技術分析顯示，櫻桃果園土壤中優勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等。生草后明顯的改變了土壤細菌群落結構，多樣性指數分析表明，種植鼠茅草后，土壤中細菌的豐富度和多樣性顯著提高，OTU數量明顯增加。這主要是因為生草后，大大提高了土壤中的養分含量，為微生物提供了豐富的碳源、氮源和其它所需養分，有利于微生物的生長繁殖。種植鼠茅草后，降低了土壤中Proteobacteria的豐度，而Acidobacteria細菌的豐度呈現上升趨勢，在屬水平上，Vicinamibacter和Brevitalea的豐度明顯增加，Sphingomonas的豐度呈現降低趨勢。魏倩倩等[34]研究發現，蘋果園中種植白三葉后明顯的改善了土壤微生物群落，微生物多樣性顯著增加。姜莉莉等[35]研究報道，在蘋果園行間種植鼠茅草處理的土壤細菌OTU、Chao1、ACE 和Shannon 指數均低于其他處理，表明其細菌群落豐度和多樣性較低，種植黑麥草處理后，土壤中的土壤鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)含量較高，本試驗測定發現櫻桃果園行間種植鼠茅草后土壤細菌多樣性升高，而種植黑麥草后，土壤中Terrimonas屬的細菌豐度升高，這個結果與本試驗結果不同，其具體原因有待進一步深入研究。

4 結 論

本研究測定了大連地區櫻桃果園行間生草后土壤溫濕度、理化性質變化，并采用高通量測序技術研究了細菌群落組成及變化。結果顯示，行間生草后，春季可以提高土壤溫濕度，夏季則降低了土壤溫度，提高了土壤濕度；土壤的有機質、氮、磷、鉀含量均顯著高于對照；土壤細菌優勢菌門為變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、放線菌門，生草后土壤中細菌多樣性和豐富度提高，種植鼠茅草后使酸桿菌門細菌豐度增加，種植黑麥草則富集了γ-proteobacteria綱細菌。