羅田板栗外生菌根真菌多樣性研究

徐碧林，王 政，羅周瑜，武 卉，鄭賀元，鄭永良

(黃岡師范學院生物與農業資源學院，經濟林種質資源改良與綜合利用湖北省重點實驗室，湖北省大別山特色資源開發協同創新中心，湖北 黃岡 438000)

【研究意義】板栗樹(Castaneamollissima)屬于殼斗科(Fagaceae)，是原產于中國并在世界范圍內廣泛種植的重要經濟落葉喬木，既可生產堅果也可用作木材[1]。據估計中國板栗樹種植面積占全世界的38%，板栗產量占全球的75%，是全球板栗產量最高的地區[2]。憑借板栗堅果獨特風味和營養成分，以及作為制作高品質家具首選木材之一，板栗樹受到越來越多的關注。此外，在過去10年間，生長在板栗樹下野生食用蘑菇的采集和商業化種植，已成為人們一項重要經濟來源[3]。然而，我國大多數板栗樹生長在與其他樹木混合的丘陵和山區。近20年來，為提高板栗產量，人們大量施用化肥、農藥和抗生素嚴重影響了自然生態系統，導致土壤和水質惡化[2, 4]。因此，為實現農業可持續發展，尋找新消除生物和非生物脅迫的策略迫在眉睫。【前人研究進展】外生菌根(Ectomycorrhiza，ECM)是菌與根相互作用的主要類型之一，外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi，ECMF)菌絲穿透根皮層細胞和表皮細胞之間的空隙，形成一個包圍植物根外部鞘的哈蒂格網絡[5-6]。在森林生態系統中，ECMF與細根形成的互利共生關系在生態功能中起著關鍵作用：菌絲體既可以增加表面積來增強植物獲取水分和營養的能力[7-8]，還可以提高作物對干旱、重金屬、病蟲害的抵抗力[8-12]，而ECMF則從它們的寄主植物接收有機化合物(如葡萄糖)[13-14]。在溫帶和北方森林中，ECM是樹木吸收養分的主要器官，據估計，這些生態系統中高達95%的根系能形成ECM[13]。殼斗科(Fagaceae)，尤其是板栗樹，是形成菌根優勢種之一[15]。Baptista等對葡萄牙東北部板栗相關的大型真菌進行研究表明，其中82%是菌根真菌[16]。Palmer等發現Scleroderma、Russula、Sebacina、Tomentella和Pezizaceae是美洲栗外生菌根真菌的優勢屬[17]。Chen等人的發現表明，與C.mollissima共生的外生菌根通過激活基因表達和H+流出來促進磷吸收[18]。此外，也有報道表明，歐洲栗樹幼苗和微繁殖植株接種菌根真菌早期可以改善植物的整體狀況[19-20]，并且可以保護植株免受墨病的侵襲[21]。以上研究表明，板栗外生菌根既提高了板栗樹的營養水平，還增強了其抗病能力。【本研究切入點】目前對“羅田”板栗菌根真菌群落結構的了解較少。羅田縣位于中國湖北省大別山地區，是中國板栗的產地之一，也是中國南方板栗的中部主產區，全縣各地共約有6萬公頃的優質板栗基地。研究表明，不同的菌根真菌對寄主植物的影響不同，且菌根真菌群落在不同生境的相同寄主植物之間存在差異[22]。綜上所述，對大別山廣泛栽培的“羅田”板栗外生菌根真菌進行系統研究，對板栗種植具有重要的指導作用?！緮M解決的關鍵問題】本研究以國家地理標志產品保護區的羅田板栗菌根真菌為研究對象，一方面運用高通量測序技術揭示其群落多樣性；同時結合菌根真菌的形態特征以及ITS序列分析對菌根真菌進行分離鑒定，以期為羅田板栗的病害防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品采集地 本研究在羅田板栗地理標志產品保護區(分布于12個鄉鎮：白廟河鄉、白蘭河鄉、大子鄉、大邊鎮、鳳山鎮、合浦鎮、九子河鎮、荒河鄉、駱駝坳鄉、平湖鄉、三里板鄉、勝利鎮)選取具有代表性大于80年的板栗果園中進行。羅田縣(115°23′57.37′′E, 30°47′2.364′′N)屬于北亞熱帶季風氣候(冬季干冷，夏季濕潤，春暖秋涼)。年均總日照時數為2047 h，年輻射熱為109.25 kcal/cm2。全年溫度范圍為-14.6～41.6 ℃，年均氣溫為16.4 ℃，平均無霜期240 d。年平均降水量為1330 mm，降雨主要集中在5、6、7月，占全年降水量的50%左右。降水和熱量與板栗產生期同步：開花期降水較少，有利于板栗授粉。梅雨季節是板栗果實生長的高峰期，也是板栗對降雨需求最大的時期。秋季干旱期是板栗的成熟期，有利于提高板栗的含糖量，降低含水量，提高板栗的品質和耐貯藏性。

1.1.2 樣品采集 在羅田板栗地理標志產品保護區的每個鄉鎮選取1個具有代表性的大于80年的板栗園，隨機抽取5個具有代表性的板栗樹(彼此間隔至少20 m)。根據Palmer等[17]描述的方法采集樣本。首先，確定與板栗根相連后，沿主根生長方向選擇側根。然后將長度為20～30 cm的完整、新鮮、有代表性的纖維根剪斷，與土塊一起裝入自封袋中并貼上標簽。每棵樹采集5個樣本。所有樣品均在4 ℃下及時保存，保存時間不超過1個月。

1.1.3 菌根處理 將采集的樣品在自來水中浸泡并用膠頭滴管沿須根生長方向仔細沖洗后，分離菌根與附著土壤和非菌根。將所有根段切成5～10 cm的小段后，在體式顯微鏡下根據菌根的大小、形狀、顏色、分叉、外延菌絲和粗糙度將ECM根(刪除根)劃分為不同顯微類型(每組1～10個根尖)，一共得到55種顯微類型。每一種顯微類型選取3個菌根混合為一個復合樣品。用75%酒精消毒30 s，5%次氯酸鈉浸泡10 min后，用無菌水沖洗4～5次后用無菌吸水紙吸干水分，并將須根兩端用無菌剪刀除去，保留中間段。將最后一次沖洗的無菌水均勻涂布于PDA培養基上，28 ℃黑暗培養3～7 d，觀察是否有菌長出，以驗證表面消毒的有效性。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取、PCR 擴增及測序分析 將上述消毒完全的樣品，按照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit說明書的步驟進行DNA提取，并用瓊脂糖凝膠檢查DNA的提取效果。然后用2×TaqPCR Mix(Takara, Japan)，通用引物ITS1F：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’[23]對ITS區段進行擴增。50 μL的反應體系含有20 ng模板，10 pmol正反引物，25 μL 2×mix。擴增條件為：94 ℃ 3 min后，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min循環30次，最后在72 ℃保持10 min。使用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega, Madison, WI, USA)進行凝膠成像檢測和定量后，合格的PCR產物送往上海生工生物工程有限公司使用Illumina MiSeq測序系統(Illumina, USA, CA)進行測序。同時，按照Palmer等[17]方法，將每種形態10個菌根尖浸泡在0.9%無菌生理鹽水中，4 ℃保存，用于ECM真菌分離鑒定。

1.2.2 菌根真菌的分離鑒定 將菌根切成2～3 cm小段，按上述方法消毒。每4～5個根段接種于PDA培養基中，28 ℃孵育6～7 d后挑取單菌落進行分離純化。根據上述方法提取菌根真菌DNA，利用瓊脂糖凝膠對DNA進行檢測后，擴增單一菌株的ITS序列，檢測合格的PCR產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。過濾后的菌根真菌ITS序列(去除不準確的頭部和尾部序列)上傳到國家生物技術信息中心(NCBI: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)使用核苷酸—核苷酸局部比對搜索工具(BLAST)與GenBank數據庫進行比對，只有在種或屬水平上被命名的庫序列被用于比對。與ITS1和ITS4區全長相似度最高(≥98%)的ECMF序列以其種名命名，如果最高序列相似度低于98%或ECM真菌序列與屬內多個物種有親緣關系，則以屬來表示[24]。最后將ECM真菌序列與文庫序列相似性最高序列一起提交進行鄰接分析。

1.3 數據處理及分析

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序序列(Sequenced Reads)。使用軟件Cutadapt去除引物接頭序列，再根據PE reads之間的重疊關系，用PEAR將成對的reads拼接成一條序列[25]。去除樣本中reads尾部質量值在20以下的堿基。設置10 bp的端口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始去除后端的堿基。切除reads中含N部分序列，并去除數據中小于200 bp的短序列。隨后再對低復雜度的序列進行過濾，得到有效數據。使用Usearch去除預處理后序列中非擴增區域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調用Uchime進行嵌合體鑒定[26-27]。隨后，再將去除嵌合體的序列與數據庫代表性序列進行比對，并剔除掉低于閾值的比對結果。通過Usearch將所有樣本序列根據序列間的距離進行聚類，然后按照97%的相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)，在此基礎上，選擇豐度最高的序列作為OTU的代表性序列，而后進行各類分析[28]。使用Mothur計算Alpha多樣性指數，如Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數及覆蓋率(coverage)等，并對相似度97%的OTU進行稀釋性分析，檢測樣品的取樣深度[29]。采用R對物種分類學統計結果作圖，計算樣品中所含何種微生物以及各微生物的相對豐度。使用GraPhlAn和iTOL對分類和系統發育信息進行可視化分析[30-31]。選取OTU聚類結果中總體豐度最大的前50個OTU聚類的代表性序列和數據庫中與這50個代表性序列種屬信息一致且最長的序列，使用MUSCLE進行多序列比對得到alignment文件，采用FastTree根據最大似然法(approximately-maximum-likelihood phylogenetic trees)構建進化樹[32]。

2 結果與分析

2.1 物種組成(OTU)分析

通過對真菌ITS1-4區段進行高通量測序(圖1)，共得到49 807條高質量序列，基于≥97%的相似度水平，通過聚類分析共獲得1782個有效OTU。隨著樣品序列數的不斷增加，當序列數超過30 000時，其稀釋性曲線越來越趨于平緩，說明即使繼續增加取樣量也只能產生極少量新的OTU。說明取樣量合理，能夠比較準確地反映板栗菌根真菌群落。

圖1 Alpha指數稀釋曲線

2.2 群落組成分析

基于OTUs聚類分析，排名前50的OTU屬于34 個屬，15個未分類的種和其他類群(圖2)。其中，Lactarius(約占60%)為優勢屬，其次為Guehomyces(約占7.9%)，Inocybe(4.56%)，Russula(3.93%)，unclassified_Thelephoraceae(2.74%)，unclassified_Ascomycota(2.21%)，以及其余屬(14.74%)。

圖2 排名前50的OTU屬水平群落結構分布

圖3顯示，在所有樣本中，豐度排名前20位的類群占95.99% 分別屬于Basidiomycota(約60%)、Ascomycota(約30%)、Mortierellomycota(約5%)，其他類群占4.01%。此外，5個優勢屬：Lactarius、Guehomyces、Inocybe、Russula和unclassified_Thelephoraceae均屬于Basidiomycota。

圖居中的是豐度前100個物種進化分類樹，并將豐度前20個物種(以星號標出)所對應的門按不同的顏色標出，圈和星號的大小代表豐度大小。外圍環為熱力圖，每一環為一個樣本(組)，每個樣本對應一種顏色。顏色深淺隨物種豐度變化

2.3 不同外生菌根的形態特征

如圖4所示，不同的外生菌根在大小、形狀和顏色上都有著顯著差異。少數菌根沒有分叉，但也有部分菌根分叉較多、分枝較長，使得菌根的形狀主要有棒狀、分叉狀、橢球狀、姜狀、辣椒狀、竹狀、樹枝狀等，因此，分叉在一定程度上反映了菌根的形態和特征。菌根顏色以棕色、黃色、黑色、灰色、白色為主，深淺層次不一。部分菌根被明顯的外延菌絲包圍，外延菌絲顏色以黑色、棕色和白色為主，特別是ECM1、CY5、ECM2、GL1、CM2、L6和YZZ29。形態學指標為后續與板栗共生的外生菌根根尖的篩選和ITS序列擴增分析提供了重要依據。

箭頭所指為外生菌根

由于具有相同形態的菌根根尖可能是由相同的ECM真菌類群形成的，所以只從具有不同形態的ECM根尖中分離ECM真菌。然而，在前50個OTU中，只從10個OTU中獲得了22株ECM真菌(表1)?；谛蛄斜葘?，在種水平上共鑒定出13株ECM真菌，在屬和門水平上分別鑒定出8和1株ECM真菌。在這些菌株中，Trichoderma菌株種類最多(6株)，Fusarium(4株)，Penicillium(3株)，Talaromyces(3株)，Pestalotiopsis(2株)，Ilyonectria、Castanediella和Leptodontidium各1株。

表1 分離菌株ITS序列與GenBank數據庫比對結果

將所有獲得的ECMF 的ITS序列與GenBank數據庫中其近親屬序列進行系統發育分析，如圖5所示。已鑒定的11株菌具有生物防治功能，分別屬于Fusarium、Trichoderma、Talaromyces和Penicillium。

菱形標記表示前期報道的具有生防作用的真菌，該進化樹使用鄰接法構建[33]，圖示為分值長度和等于0.95921366的最優進化樹。分支旁顯示了在引導測試中關聯類群聚類的復制樹的百分比(1000個重復)[34]。進化樹是按比例繪制的，分枝長度與用來推斷系統發育樹的進化距離單位相同，進化距離是以每個位點的堿基替換數為單位采用最大復合似然法計算的[35]。該進化分析用MEGA7軟件完成，一共涉及44條核苷酸序列，所有空格和缺失數據的317個位置均被剔除[36]

3 討 論

本文對羅田板栗ECM真菌群落進行了調查，在屬水平上共發現50個ECM真菌類群。在所有的樣品中，豐度前20的種分別屬于Basidiomycota(約占60%)，Ascomycota(約占 30%)，Mortierellomycota(約占5%)和未分類真菌(約占5%)。此外，5個優勢類群：Lactarius、Guehomyces、Inocybe、Russula和unclassified_Thelephoraceae都屬于Basidiomycota。

雖然物種豐富度存在差異，但物種豐富度最高的屬為Lactarius，占所有菌株的63.9%，是羅田板栗的優勢屬。據統計，在葡萄牙東北部、美國和意大利板栗的板栗果園中發現了數十種ECM真菌，其中Lactarius是優勢屬之一[16, 37-39]。此外，本研究中檢測到的分別占4.56%、3.93%、1.63%和1.3%的Inocybe、Russula、Tomentella和Tricholoma均為已報道的板栗菌根真菌[16, 37, 39-40]?；谝陨辖Y果，可以推斷Lactarius、Inocybe、Russula、Tomentella和Tricholoma可能是與板栗共生的廣譜真菌。不僅如此，除了Tricholoma的上述其余4個屬均能與殼斗科植物共生[41-44]。上述結果表明，Lactarius、Inocybe、Russula和Tomentella的ECMF可能是殼斗科植物的重要共生類群，在殼斗科植物的生長發育中發揮著重要作用。然而，與其他板栗園ECM真菌群落結構相比，研究區板栗外生菌根群也表現出一定的特殊性：Gyroporus、Verticillium等7個類群此前均未見報道，它們可能是羅田板栗林區特有的，但該結果有待進一步研究證實。

Trichodermasp.是最成功的生物防治有益菌之一，在農業生產微生物病害防治中發揮著重要作用。Murolo等[45]發現Trichodermaspp.對Cryphonectriaparasitica引起的栗疫病有一定的抗性。Banerjee等[46]的研究結果表明Trichodermavirens能抑制引起黃檀屬枯萎病菌株80%的菌絲生長。Baiyee等[47]發現TrichodermaspiraleT76-1對Corynesporacassiicola或Curvulariaaeria引起的萵苣(LactucasativaL.)葉斑病具有生物防治活性。通過將孢子懸浮液加入移植盆栽組合，并將生菜幼苗種植到小菌核菌侵染的區域，在非常高的疾病壓力(100%)下，與未處理的對照相比，TrichodermahamatumLU595和LU593可以減少30%～50%的患病率[48]。此外，研究發現，作為細胞壁降解酶(CWDEs)生產者的TrichodermavelutinumACR-P1可被開發用于生物防治[49]。除Trichodermasp.外，Fusariumsp.在生物防治中也起著重要作用。Singh等[49]發現，從民間藥用植物CissusquadrangularisL.中分離的FusariumproliferatumACQR8具有抗菌潛力。此外，一株非致病性Fusariumoxysporum被證明是一種潛在的橄欖黃萎病生物防治劑[45]。Wei等[50]研究表明，FusariumsolaniCEF559在田間試驗中減少30.1%～56.3%枯萎病的發生。Alam等[51]研究表明，施用植物生長促進菌(PGPF)Penicilliumsp.EU0013作為生防劑，可以有效地防治茄藻引起的秋葵根腐病。Miyake等[52]從一株水稻幼苗中分離得到的Talaromycessp.KNB422對幾種水稻幼苗病害有較好的防治效果。上述結果表明，本研究分離得到的菌株T.velutinumCY5、T.virensYZZ29、T.spiraleWD4、T.hamatumGL1、F.proliferatumECM1、F.oxysporumWD5、F.oxysporumBH、F.solaniC8、Penicilliumsp.TCM14-1、Penicilliumsp.TCM26和Talaromycessp.WNN可能也具有潛在的生物防治功能。

然而，本研究僅分離到少數(22株)板栗菌根真菌，其中只有7株(均屬于Ascomycota)屬于豐度前20的分類群，其余15株為稀有種?？赡苡幸韵聨讉€原因：①非培養菌活菌(Viable but non-culturable，VBNC)占自然環境微生物的99%以上，目前，在實驗室用常規方法無法分離得到這些菌株[53]，部分ECMF可能屬于VBNC，導致可培養ECMF比例降低；②由于兩個或兩個以上近緣種在形態上的相似性，通過形態分型可能將它們歸為一類，這可能增加準確區分ECM根(刪除根)的誤差，并導致可培養ECMF的低估；③單季度取樣也可能會在準確探索ECM真菌種類方面造成誤差，因為ECM真菌種類可能隨天氣條件，特別是降雨而波動；④由于對目標微生物所處的自然環境缺乏了解，例如對在微生物生長和代謝過程中起關鍵作用營養因素的認識不足，不同生理階段對底物濃度的要求以及生長所需環境條件變化規律不明，導致無法為目標微生物生長提供營養需要和培養條件[54]；⑤一些寡養或生長緩慢的微生物細胞通常形成超細菌落。如果培養時間不夠或者檢測技術的靈敏度不高，那么這些微生物的生長就不容易被檢測到，往往被忽視，并被定義為“未培養”[55]。因此，采用單一培養基(PDA)和僅僅一周的培養時間可能會導致很多ECMF無法培養。綜上所述，連續長時間多采集根系樣品、改善分離方法和培養條件，才能更準確地了解ECM真菌的多樣性，獲得更多可培養的ECM真菌。

4 結 論

通過對羅田板栗菌根真菌的系統研究，本研究揭示了羅田板栗菌根真菌的群落結構，并分離得到11株具有潛在生物防治功能的菌根真菌，為羅田板栗病害科學防控奠定基礎。