OGP對低氧環境中小鼠BMSCs成脂分化影響的研究

張磊 龔躍昆 尹勇*

1. 云南大學附屬醫院康復醫學科，云南 昆明 650000 2. 昆明醫科大學第一附屬醫院骨科，云南 昆明 650000

骨質疏松癥是一種全身代謝性骨病，其特征為骨密度降低、骨組織顯微結構破壞及易于骨折，顯著增加患者死亡率和致殘率[1-2]，已經對全球公共衛生構成極大挑戰。然而骨質疏松癥的病因及發病機制目前仍然不清楚，其中BMSCs成骨與成脂肪分化失衡是骨質疏松發病的重要機制之一，即BMSCs向成脂肪分化增加而向成骨分化明顯減少，因此如何促進BMSCs向成骨分化而減少成脂分化是目前研究的熱點[3-4]。成骨生長肽(OGP)由14個氨基酸殘基組成的多肽，羧基端五肽為其活性形式。現在已經可以人工合成OGP，其能夠明顯促進BMSCs增殖和成骨分化[5-6]，但是關于OGP對間充質干細胞成脂分化影響的報道非常少[7]。越來越多的研究[8-9]表明低氧環境培養能明顯影響BMSCs成骨成脂分化，同時我們前期研究表明低氧環境及OGP均能促進BMSCs的成骨分化[10]；而現有研究[11-12]關于低氧對BMSCs成脂肪分化影響的報道并不一致。本文擬探討OGP、低氧及二者聯合對BMSCs成脂肪分化的影響，以期為骨質疏松癥的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級昆明小鼠(昆明醫科大學實驗動物中心)，成骨生長肽(北京博奧森)，PPARγ抗體(Bioss公司)，C/EBPα抗體(Proteintech公司)，GAPDH抗體(CST公司)，HIF-1α ELISA試劑盒(R&D公司)，低糖DMEM培養基(Sigma公司)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma公司)，胰島素(Sigma公司)，Platinum? SYBR? Green qPCR試劑盒(Invitrogen公司)，Golden Taq PCR試劑盒(北京天根生化公司)，Superscript III cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司)，Trizol裂解液(Invitrogen公司)，地塞米松(Sigma公司)。

1.2 骨髓間充質干細胞分離、培養與鑒定

骨髓單個核細胞分離于小鼠股骨骨髓腔，分離后檢測CD44、CD34、CD90、CD29細胞表面標志，同時結合細胞多向分化鑒定BMSCs[13]。

1.3 實驗分組

實驗共分為4組：A組(常氧條件下培養)；B組(1% O2條件下培養)；C組(常氧培養條件下添加10-9mol/L OGP)；D組(1%O2條件下添加10-9mol/L OGP)。根據既往實驗，本研究選擇1% O2與 10-9mol/L OGP作為干預濃度[10]。實驗均采用成脂肪誘導細胞培養基(含10%胎牛血清的低糖DMEM+10-6mol/L+0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+10 μg/mL胰島素+100 μg/mL吲哚美辛)。

1.4 ELISA法檢測HIF-1α的表達

培養1 d后收集細胞上清液測定蛋白濃度，采用雙抗體夾心法檢測HIF-1α，最后在450 nm處檢測光密度值。具體實驗方法依照課題組既往實驗步驟進行法檢測[10]。HIF-1α檢測結果以pg/mg總蛋白表示。

1.5 油紅O染色

棄培養液，用1×PBS洗滌2次，中性甲醛固定30 min；隨后加入油紅O染液染色30 min，最后鏡下觀察脂滴。隨機選取5個高倍視野，計數陽性細胞，統計學處理。

1.6 實時熒光定量PCR檢測

培養14 d后收集細胞，隨后RNA提取及反轉錄合成cDNA。引物序列見表1，擴增反應條件為95 ℃變性2 min，40個循環(95 ℃ 15 s，54 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s)。β-actin作為內參，目的基因表達量以2-ΔΔCt法進行相對定量分析，將A組各基因表達量設定為1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 Western blot檢測

14 d后收集細胞，每組取等量蛋白進行電泳轉膜，5% 牛血清白蛋白封閉2 h，加入抗PPARγ(1∶1 000)及抗C/EBPα (1∶1 000)單克隆抗體4 ℃孵育過夜，隨后二抗GAPDH 抗體(1∶2 000)37 ℃孵育2 h；GAPDH 為內參蛋白。目的蛋白與內參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 ELISA檢測

A組與C組幾乎未能檢測到HIF-1α蛋白表達。與A組對比，B組與D組能明顯上調HIF-1α蛋白的表達(P<0.01)；B組與D組HIF-1α蛋白表達量差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 油紅O染色分析

油紅O染色將脂肪染成紅色。A組可見大量含脂滴的陽性細胞，B組與C組細胞脂滴生成減少，D組細胞脂滴生成明顯減少。B組、C組及D組與A組相比，B組、C組及D組脂肪滴形成明顯減少(P<0.01)；B組與C組相比，脂肪滴形成差異無統計學意義(P>0.05)；與B組及C組相比，D組脂肪滴形成明顯減少(P<0.01)。見圖1及圖2。

圖1 各組細胞培養14 d油紅O染色圖片Fig.1 Oil red O staining observation at 14d of culture in each group注：A：A組，B：B組，C：C組，D：D組。

圖2 脂肪滴形成細胞數Fig.2 The lipid positive BMSCs注：與A組相比，*P<0.01；與D組相比，△P<0.01。

2.3 實時熒光定量PCR分析

培養14 d后，低氧環境及成骨生長肽均能明顯降低PPARγ與C/EBPα mRNA的表達。與A組相比，B組、C組及D組中PPARγ與C/EBPα mRNA的表達明顯下調(P<0.01)；B組與C組相比差別無統計學意義(P>0.05)；與B組及C組相比，D組PPARγ與C/EBPα mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 PPARγ mRNA與C/EBPα mRNA表達水平的qPCR分析Fig.3 The mRNA expression of PPARγ and C/EBPα detected with qPCR注：與A組相比，*P<0.01；與D組相比，△P<0.01。

2.4 Western blot分析

Western blot檢測顯示，培養14 d后，低氧環境及成骨生長肽均能明顯降低PPARγ與蛋白水平的表達。與A組相比，B組、C組及D組中PPARγ與C/EBPα 蛋白表達明顯下調(P<0.01)；B組與C組差別無統計學意義(P>0.05)；與B組及C組相比，D組PPARγ與C/EBPα 蛋白表達降低(P<0.01)。見圖4。

3 討論

低氧適應性反應由hypoxia inducible factor (HIF)介導，在包括紅細胞生成、新生血管生成、血管舒張、無氧代謝等多方面發揮重要作用。HIF-α包括HIF-1α與HIF-2α[10]。α亞基是功能亞基，在常氧條件下不穩定，因此不能檢出[10,14-15]。本實驗中ELISA法檢測到B組與D組培養24 h后HIF-1α蛋白表達明顯上調，而C組與D組未能檢測到HIF-1α蛋白的表達。表明我們實驗中采用1%的O2能引起低氧適應性反應。

圖4 PPARγ與C/EBPα 蛋白表達水平的Western-blot分析Fig.4 The protein expression of PPARγ and C/EBPα detected with western-blot注：與A組相比，*P<0.01；與D組相比，△P<0.01。

越來越多的研究表明HIF在干細胞的定向分化中發揮著重要作用，包括成肌分化、成骨分化、成神經分化、成軟骨分化、成肌腱定向分化等[16-18]。課題組前期研究已經表明1%低氧培養能促進BMSCs成骨分化，而關于低氧環境對BMSCs成脂肪分化影響的研究相對較少，且不同研究結論并不一致。Park等[11]研究表明1%O2培養通過HIF-1α依賴的方式阻止GSK3β入核及C/EBP與DNA結合能力，從而阻止3T3-L1細胞的成脂肪分化。Camacho-Cardenosa等[19]的研究表明在(17.2±0.3)% FiO2下12周高強度間歇訓練比正常氧環境中(20.9% FiO2)12周高強度間歇訓練更能降低肥胖女性減少脂肪含量，同時增加肌肉含量。Wagegg等[12]的研究表明2%O2培養環境能以HIF依賴的方式抑制干細胞成脂肪分化而促進成骨分化。Wang等[20]的研究發現間歇低氧，即每個循環1%O210 min隨后21% O25 min，能促進脂肪前體祖細胞向脂肪細胞的分化。伍志偉等[21]的研究發現3%、6%、12%、20% O2培養均能促進骨髓間充質干細胞的成脂肪分化。Jiang等[22]研究發現0.2%的低氧環境培養通過上調HIF-1α和C/EBP表達，促進間充質干細胞的成脂分化。Weiszenstein等[23]的研究發現4%的低氧環境明顯促進小鼠3T3-L1細胞脂滴形成和成脂分化，而1%低氧環境減少細胞脂滴聚集并抑制成脂分化。本實驗結果表明1% O2培養能夠明顯減少細胞中脂滴的形成及下調成脂肪分化相關轉錄因子PPARγ和C/EBPαmRNA和蛋白水平的表達，抑制小鼠骨髓間充質干細胞成。筆者推測不同研究中低氧對間充質干細胞成脂分化作用不一致，可能與不同實驗中低氧的濃度不同、低氧的給養方式及不同的細胞種類有關。這需要下一步對上述不同因素進行對比研究以確定相關不同因素的影響作用。

成骨生長肽是一種內源性多肽。已經有大量的體外研究表明OGP能促進成骨前體細胞的成骨分化，顯示出其在骨質疏松癥治療中的潛在作用靶點[24-25]；同時也有研究[5-6]表明OGP與支架材料復合后能增強支架材料的骨誘導性能，促進骨組織的修復。Chen等[7]研究發現OGP不僅能促進BMSCs成骨分化，同時也能明顯抑制其成脂分化。本研究表明在體外OGP能明顯減少BMSCs脂滴的形成，同時下調PPARγ和C/EBPα的表達，抑制小鼠骨髓間充質干細胞成脂肪分化，且與低氧環境對BMSCs成脂分化抑制具有協同作用。

BMSCs能夠定向分化為多種終末細胞。越來越多的研究[1,4]表明MSCs成骨成脂分化失衡是骨質疏松癥發病的重要機制之一。間充質干細胞的成脂分化受到信號通路的調控，其中PPARγ和C/EBPα是間充質干細胞成脂分化中最為重要的轉錄因子，能夠誘導脂肪細胞關鍵基因的表達，是終末脂肪細胞形成所必須的[26-27]。本實驗結果顯示，1%O2與OGP均能明顯抑制PPARγ和C/EBPα mRNA和蛋白水平的表達，表明二者均能抑制干細胞的成脂分化。同時，課題組前期研究已經表明低氧及OGP均能明顯促進間充質干細胞的成骨分化[10]，因此筆者認為低氧與OGP在包括骨質疏松癥在內的成骨成脂分化失衡等脂代謝紊亂疾病中具有良好的臨床應用前景。但是，目前尚未見到關于OGP對BMSCs成脂分化影響相關分子機制的報道，而關于低氧對BMSCs成脂分化影響相關分子機制報道也相對較少。Wang等[28]的研究表明低頻間歇低氧可能是通過巨噬細胞極化導致小鼠皮下脂肪組織的成脂肪分化能力降低。Wang等[20]的體外研究表明低頻間歇低氧是通過激活(IGF-1R)/Akt信號通路而促進脂肪前體細胞的成脂肪分化。

綜上，本實驗研究發現1%O2環境培養與OGP均能明顯抑制間充質干細胞的成骨分化，且二者聯合應用時具有協同效應，對間充質干細胞具有更強成脂肪分化抑制作用。但是目前關于低氧與OGP對BMSCs成脂分化影響的分子機制并不清楚，我們下一步將就OGP與低氧對BMSCs成脂分化影響的相關分子機制進行研究。