人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 改善東莨菪堿致小鼠認(rèn)知障礙的作用比較

魏山山 王孟迪 姜 寧 Ayaz Ahmed 劉新民*王 瓊*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國際合作中心/中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,四川 瀘州 646000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心,北京 100193；4.巴基斯坦卡拉奇大學(xué)國際化學(xué)和生命科學(xué)研究院Panjwani 博士分子醫(yī)學(xué)和藥物研究中心,巴基斯坦 卡拉奇74200)

認(rèn)知障礙是阿爾茲海默病(Alzheimer’ s disease,AD)的主要癥狀,其短期學(xué)習(xí)記憶受損是該疾病特征性的早期臨床表現(xiàn),也是腦疾病診斷和治療中最困難的問題之一[1-2]。據(jù)阿爾茨海默病協(xié)會報告,每3 s 就會有一人患癡呆癥[3]。預(yù)計到2050年,國際上的癡呆癥患者數(shù)將高達(dá)1.52 億,其照護(hù)費用高達(dá)2 萬億美元,給整個社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4-5]。

AD 發(fā)病機制復(fù)雜,至今為止,其詳細(xì)明確的病因仍不清楚,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能的損傷以及相關(guān)蛋白通路的異常表達(dá)都會導(dǎo)致認(rèn)知障礙。盡管西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)化的靶向治療能短期改善臨床癥狀,但并不能延緩疾病的發(fā)展,且副作用大[6]。

中藥對于認(rèn)知功能障礙的治療,始終堅持"辨證論治"和"整體觀"的原則,已在病因病機探討、疾病預(yù)防、藥物治療方面取得了大量的進(jìn)展,且中藥具有副作用小,多靶點多途徑的特點[7-8]。在中醫(yī)學(xué)中,癡呆早期階段多為虛證,且以補益藥為主。作為補益藥之首的人參在不同疾病的不同階段發(fā)揮了重要作用[9]。近年來,隨著傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代藥理研究,借助分離技術(shù)的應(yīng)用,我們發(fā)現(xiàn)人參具有復(fù)雜的化學(xué)成分、廣泛的生物活性和獨特的藥理作用,其中最重要的活性成分是人參皂苷[10]。在大量現(xiàn)代藥理研究中,人參皂苷已被證明其能應(yīng)用多元化的靶點治療相關(guān)疾病[11]。此外,在中藥神經(jīng)藥理學(xué)研究中,人參皂苷已被證明具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[12]。其中,達(dá)瑪烷型人參皂苷Rg1、Rb1 已被廣泛證明在不影響中樞運動神經(jīng)的情況下可從多途徑改善認(rèn)知功能障礙,包括介導(dǎo)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡、抑制淀粉樣蛋白的沉積、調(diào)節(jié)各類神經(jīng)遞質(zhì)水平等[13-15]。盡管人參皂苷Rg1、Rb1 的單獨使用已被證明能夠改善認(rèn)知功能障礙[16],但人參皂苷Rg1+Rb1 對于東莨菪堿(scopolamine,Scop)模型小鼠所引起的短時空間與非空間學(xué)習(xí)記憶改善作用及機制尚不清楚。因此,本研究采用東莨菪堿腹腔注射所致認(rèn)知障礙模型,比較人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿認(rèn)知障礙模型所引起短時空間與非空間學(xué)習(xí)記憶力的影響及差異,并對其作用及機制進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只體重為20～22 g 的雄性SPF 級ICR 小鼠(3 周齡)購自北京維通利華實驗動物公司[SCXK(京)2021-0006]并飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所[SYXK(京)-2017-0020]。小鼠在正式實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。在此期間保持飲食和水源的充足。光暗將交替循環(huán)(12 h:12 h),室溫21℃～24℃,濕度條件為(55±10)%。本實驗經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實驗動物倫理委員會審批(SLXD-202107020023)。

1.2 主要試劑與儀器

人參皂苷Rg1(CAS:22427-39-0)、人參皂苷Rb1(CAS:41753-43-9)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；石杉堿甲(Huperzine A,批號:H10940156)購于河南太龍藥業(yè)股份有限公司；氧化應(yīng)激的試劑盒包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,批號:20210924)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH,批號:20210923)、過氧化氫酶(catalase,CAT,批號:20210917)、丙二醛(malondialdehyde,MDA,批號:20210916)購于南京建成生物工程研究所；東莨菪堿氫溴酸鹽(Scopolamine hydrobromide trihydrate,1 g,CAS 號:6533-68 -2) 購于麥克林公司；乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach,批號:123K262)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT,批號:114K702)、谷氨酸(Glutamate,Glu,批號:140690-20120)均購于美國Sigma 公司。

小鼠物體認(rèn)知識別實驗儀器是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員科研訓(xùn)練中心和北京康森益友科技有限公司聯(lián)合研發(fā)；Q-Trap5500型質(zhì)譜分析儀(美國應(yīng)用生物技術(shù)公司)；Vibra-Cell 型超聲波破碎儀(美國Sonics 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及給藥

將60 只實驗鼠按照每組10 只的標(biāo)準(zhǔn)分為對照組,模型組(東莨菪堿組,Scop,1 mg/kg),石杉堿甲組(Hup,0.1 mg/kg),人參皂苷Rg1 組(60 μmol/kg),人參皂苷Rb1 組(60 μmol/kg),人參皂苷Rg1+Rb1 組(30+30 μmol/kg)。給藥組灌胃給藥14 d,其余組給予蒸餾水,第15 天時,除對照組外,其余組將在給藥30 min 后進(jìn)行東莨菪堿腹腔注射,使其誘導(dǎo)認(rèn)知障礙。腹腔注射間隔30 min 再進(jìn)物體認(rèn)知識別實驗,每天持續(xù)給藥直到行為學(xué)結(jié)束為止。

1.3.2 物體位置識別實驗

物體位置識別實驗參考本實驗室建立的方法[17]并作細(xì)微修改后進(jìn)行。簡而言之,該實驗共計4 d(3 個階段)。前3 d 為適應(yīng)期,熟悉期和測試期在第4 天分時段進(jìn)行。適應(yīng)期時,動物每天同一時間段被放于測試箱中自由活動10 min。第4 天上半時段為熟悉期,在兩測試箱內(nèi)右上角側(cè)內(nèi)固定位置分別放一個相同的物體,將小鼠放入后5 min 的探索行為將被自動記錄。間隔30 min 進(jìn)入測試期。測試期間,兩個相似物體中的其中一個將被移到另一物體的斜對角,5 min 的自由探索行為將再次被記錄。

1.3.3 新物體識別實驗

新物體實驗的方法與物體位置識別實驗基本相同。不同的是,測試期內(nèi)將其中一個物體換為另一新物體,其放置位置未作改變。記錄5 min 內(nèi)小鼠對兩物體的探索時間[18]。

1.3.4 海馬神經(jīng)遞質(zhì)水平測定

(1)樣品處理

所有行為學(xué)檢測完成后,將小鼠處死,剝開頭骨,在冰上迅速分離出海馬并稱重之后加入超純水(50 μL)超聲勻漿(10 s)。20 μL 的IS 溶液將被加入到50 μL 勻漿液中,渦旋混勻后,加入10 μL 的三氯乙酸沉淀蛋白,4℃低溫離心(2×104r/min,15 min),取40 μL 上清液放入4℃冰箱,次日檢測[19]。

(2)含量測定

含量測定參見本課題組先前建立的方法[20],用于定量分析的離子為m/z 146.1→87.4(ACh)；m/z 177.0→160.0(5-HT)；m/z 148.0→84.0(Glu)。

1.3.5 氧化應(yīng)激水平測定

四個氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)(SOD、CAT、GSH、MDA)按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析,所有值記為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(),P＜0.05 表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異。物體位置識別實驗和新物體識別實驗熟悉期對A1 和A2 的探索時間采用配對t檢驗進(jìn)行分析。其余實驗數(shù)據(jù)符合正太分布,各參數(shù)組間差異采用單因素方差(One-way ANOVA)分析；若數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布或者方差不齊,使用非參數(shù)檢驗(Nonparametric tests)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠短時空間記憶力的影響

圖1A 所示,在熟悉期實驗階段,與Scop(1 mg/kg)組比較,對照組人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、Rb1(60 μmol/kg)、Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)的探索總時間沒有顯著差異,與人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)比較,Hup(0.1 mg/kg)的總探索時間顯著減少(P＜0.01),表明模型組動物對物體的探索能力沒有差異。圖1B 所示,各組動物對熟悉期的兩物體未見位置偏好。圖1C 所示,與對照組比較,Scop(1 mg/kg)的相對辨別指數(shù)顯著下降(P＜0.001)；與Scop(1 mg/kg)比較,HUP(0.1 mg/kg)、人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、Rb1(60 μmol/kg)、Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)給藥組都能顯著提高東莨菪堿小鼠的相對辨別指數(shù)(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.05)。但與人參皂苷Rb1(60 μmol/kg)比較,人參皂苷人Rg1(60 μmol/kg)改善短時空間記憶力的能力無顯著性差異,而人參皂苷Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)改善短時空間記憶力的能力有所下降(P＜0.01)。

圖1 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠物體位置識別實驗中左右位置偏好、探索總時間、相對辨別指數(shù)的影響(,n=8～10)Note.Compared with the control group,***P ＜0.001.Compared with the model group,#P ＜0.05,##P ＜0.01,###P ＜0.001.Compared with ginsenoside Rb1,&&P＜0.01.Compared with ginsenoside Rg1,^^P＜0.01.Figure 1 Effects of Ginsenoside Rg1,Rb1 and Rg1+Rb1 on left-right position preference,total exploration time and relative discrimination index of scopolamine mice in object recognition task

2.2 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠短時非空間記憶能力的影響

圖2A 所示,在熟悉期實驗階段,與Scop(1 mg/kg)組比較,對照組和人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、Rb1(60 μmol/kg)、Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)的探索總時間沒有顯著差異；與人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、Rb1(60 μmol/kg)比較,模型組動物對物體的探索能力沒有差異。圖2B 所示,各組動物對熟悉期的兩物體未見位置偏好。圖2C 所示,與對照組比較,Scop(1 mg/kg)組的相對辨別指數(shù)顯著下降(P＜0.001)；與Scop(1 mg/kg)組比較,HUP(0.1 mg/kg)、人參皂苷Rg1 (60 μmol/kg)、Rb1 (60 μmol/kg)、Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)給藥組都能顯著提高東莨菪堿小鼠的相對辨別指數(shù)(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.01)。此外,與人參皂苷Rb1(60 μmol/kg)比較,人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、人參皂苷Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)給藥組改善短時非空間記憶能力并未出現(xiàn)顯著差異性。

圖2 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠新物體識別實驗探索總時間、左右位置偏好、相對辨別指數(shù)的影響(,n=8～10)Note.Compared with the control group,***P＜0.001.Compared with the model group,##P＜0.01,###P＜0.001.Compared with ginsenoside Rb1,&P＜0.05.Compared with ginsenoside Rg1,^P＜0.05.Figure 2 Effects of Ginsenoside Rg1,Rb1 and Rg1+Rb1 on left and total exploration time,right position preference and relative discrimination index of scopolamine mice in novel object recognition

2.3 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)的影響

圖3A～3C 所示,與對照組比較,Scop(1 mg/kg)組海馬中的神經(jīng)遞質(zhì)ACh、5-HT、Glu 水平都顯著下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)；與Scop(1 mg/kg)比較,Hup(0.1 mg/kg)、人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、Rb1(60 μmol/kg)、Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)都能顯著提高神經(jīng)遞質(zhì)ACh、5-HT、Glu 水平。此外,與人參皂苷Rb1(60 μmol/kg)比較,人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、人參皂苷Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)對于調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)ACh、5-HT、Glu 水平的能力并未出現(xiàn)顯著性差異。

圖3 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠海馬神經(jīng)遞質(zhì)的影響(,n=8～10)Note.Compared with the control group,** P＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 3 Effects of Ginsenoside Rg1,Rb1 and Rg1+Rb1 on hippocampal neurotransmitters of scopolamine mice

2.4 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠血清氧化應(yīng)激的影響

如圖4A～4D 所示,與對照組比較,Scop(1 mg/kg)組能使小鼠血清中SOD、CAT、GSH 活力顯著下降和使MDA 含量顯著升高(P＜0.001,P＜0.001,P＜0.05,P＜0.001)。與Scop(1 mg/kg)組比較,Hup(0.1 mg/kg)、人參皂苷Rg1(60 μmol/kg)、Rb1(60 μmol/kg)、Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)能顯著提高血清中SOD、CAT、GSH 活力和降低MDA 的含量。此外,與人參皂苷Rb1(60 μmol/kg)比較,人參皂苷Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)對于調(diào)節(jié)GSH 的能力有所下降(P＜0.01)。與人參皂苷Rg1、Rb1(30 μmol/kg)比較,人參皂苷Rg1+Rb1(30+30 μmol/kg)調(diào)節(jié)MDA 含量的能力顯著上升(P＜0.05)。

圖4 人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 對東莨菪堿小鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響(x-±sx-,n=8)Note.Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Compared with the model group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Compared with ginsenoside Rb1,&P＜0.05,&&P＜0.01.Compared with ginsenoside Rg1,^P＜0.05.Figure 4 Effects of Ginsenoside Rg1,Rb1 and Rg1+Rb1 on serum oxidative stress level of scopolamine mice

3 討論

在老年癡呆防治藥物篩選的研究中,模擬癡呆主要癥狀的認(rèn)知障礙模型占據(jù)重要地位[21-22]。膽堿功能障礙假說在AD 發(fā)病機制中占據(jù)不可估量的地位[23-24]。東莨菪堿腹腔注射所致認(rèn)知障礙模型是模擬認(rèn)知障礙模型的經(jīng)典模型[25]。學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)檢測方法分為三大類:懲罰(跳臺、避暗、穿梭和迷宮)、獎賞(獎賞操作條件反射、食物性迷宮)和自主選擇(物體識別)等。水迷宮、物體位置和新物體識別是檢測空間學(xué)習(xí)記憶和非空間學(xué)習(xí)記憶的主要行為學(xué)檢測方法,而后兩者是公認(rèn)的評價短時空間和非空間學(xué)習(xí)記憶的動物行為學(xué)評價方法[26]。有研究表明,膽堿能神經(jīng)功能障礙可引起短時學(xué)習(xí)記憶的損傷[27]。本實驗結(jié)果與其一致,在物體位置識別實驗中,與空白組比較,東莨菪堿模型小鼠的短時空間學(xué)習(xí)記憶顯著下降；在新物體識別實驗中,與空白組比較,模型小鼠的短時非空間學(xué)習(xí)記憶也出現(xiàn)顯著性下降的結(jié)果。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn),除中樞膽堿能系統(tǒng)中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)維持正常水平是認(rèn)知功能正常的重要影響因素之外[28],單胺類、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)[29-30]。例如,大蒜素通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE、5-HT、GABA 和Glu 的水平可以改善鋁和銅誘導(dǎo)Wistar 大鼠導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙[31]。本研究也表明,模型組的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)Ach、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu水平顯著下降。

氧化應(yīng)激可引起神經(jīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、突觸功能受損及線粒體損傷。大量研究證明,SOD、GSH、MDA、CAT 的水平變化可以綜合反應(yīng)大腦的氧化應(yīng)激狀態(tài)[32-35]。GSH 和SOD 為機體內(nèi)的重要抗氧化酶,MDA 是機體氧化應(yīng)激反應(yīng)中的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,CAT 可清除體內(nèi)的過氧化氫而保護(hù)機體免受損害[36]。本研究模型組的SOD、GSH、CAT 水平顯著下降、MDA 的水平顯著增高。

人參作為治療癡呆的中藥已多有報道[37]。近幾十年的現(xiàn)代藥理研究中發(fā)現(xiàn),人參皂苷是人參的主要活性成分,其結(jié)構(gòu)確定的皂苷成分就有40 余種,而人參皂苷Rg1、Rb1 的含量最高[38]。例如,向玥等[39]通過懲罰類Morris 水迷宮行為學(xué)檢測方法發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1 能顯著改善D-半乳糖(D-gal)所致認(rèn)知障礙小鼠的空間位置辨知的長時學(xué)習(xí)記憶能力。Zhang 等[40]通過懲罰類Morris 水迷宮法發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1 能顯著改善淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)腦室注射學(xué)習(xí)記憶障礙模型大鼠的長時空間學(xué)習(xí)能力。本實驗結(jié)果表明,人參皂苷Rg1、Rb1、人參皂苷Rg1+Rb1 在改善空間短時學(xué)習(xí)記憶和非空間短時學(xué)習(xí)記憶的能力有一定差異。在新物體實驗中發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、Rb1、人參皂苷Rg1+Rb1 改善模型組非空間短時學(xué)習(xí)記憶的能力相當(dāng),其主要表現(xiàn)為對于神經(jīng)遞質(zhì)ACh、5-HT、Glu 和氧化應(yīng)激SOD、CAT 水平的調(diào)節(jié)。在早期對Rg1 和Rb1 抗學(xué)習(xí)記憶機制的初步研究中就發(fā)現(xiàn)[39],Rb1 可以拮抗脂質(zhì)過氧化,清除氧自由基,增加過氧化氫酶和GSH-PX 活性,而Rg1 沒有。在本研究中在GSH 指標(biāo),Rb1 的效果優(yōu)于聯(lián)合用藥,可能是Rg1、Rb1 聯(lián)合應(yīng)用用藥劑量減半組合后改善這類指標(biāo)的劑量未達(dá)到。且先前有研究表明,人參皂苷Rg1 和Rb1組合與黃芪甲苷聯(lián)合應(yīng)用會增強MDA 含量的增加。在本研究中,與其結(jié)果一致,聯(lián)合用藥調(diào)節(jié)MDA 含量的效果優(yōu)于單獨使用任何一個藥[41]。

綜上所述,本實驗采用東莨菪堿小鼠腹腔注射成功建立了短期空間與非空間學(xué)習(xí)記憶損傷的認(rèn)知障礙模型,并分別運用了動物認(rèn)知行為學(xué)評價方法、LC-MS-MS 法、比色法對人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 改善認(rèn)知障礙模型小鼠行為學(xué)和腦組織進(jìn)行了一系列的觀察,發(fā)現(xiàn)盡管人參皂苷Rg1+Rb1 在各自有效劑量減半重新組合的情況下,人參皂苷Rg1+Rb1 改善短時空間短時學(xué)習(xí)記憶的能力有所下降。但人參皂苷Rg1、Rb1、Rg1+Rb1 在改善短時非空間學(xué)習(xí)記憶損傷的能力依然相當(dāng),足以說明Rg1+Rb1聯(lián)用依然顯示出在改善學(xué)習(xí)記憶損傷上有一定的優(yōu)勢。其機制可能與有效調(diào)節(jié)腦內(nèi)不同類神經(jīng)遞質(zhì)和氧化應(yīng)激水平的能力有關(guān)。