廣西地區男性不育患者AZFc部分缺失與生精障礙的關系研究▲

莫定敢 唐蘭艷

廣西壯族自治區生殖醫院，南寧市 530218

近年來，我國不孕不育患者數量逐年增多，不孕不育已成為我國重要的醫學和社會問題。調查結果[1]顯示，不孕不育癥的一半原因在于男性，而其中超過30%的原發性男性不育與Y染色體微缺失所導致的生精障礙有關。研究[2-6]發現，男性Y染色體上“無精子因子”區(AZF)是實現生精及維持生精功能不可或缺的因子，AZF部分缺失是男性生精障礙的重要影響因素，其中大部分的AZF缺失發生在AZFc區(其他兩個區域為AZFa、AZFb)，而男性遺傳性生精障礙與AZFc區中的DAZ基因拷貝數差異有關；男性生精障礙患者的AZFc缺失在不同地域、種族之間存在較大差異。為探討廣西地區男性不育患者AZFc部分缺失與生精障礙的關系，本研究選取廣西地區男性生精障礙患者268例以及同期正常體檢者100例為研究對象進行了檢測分析。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2021年9月在我院接受診治的不育男性患者268例為患者組，年齡26～45歲。納入標準：(1)根據臨床檢查結果、參照男性不育的診療指南[7]確診為男性不育；(2)祖籍為廣西地區。排除標準：(1)梗阻性無精子癥患者；(2)精索靜脈曲張、隱睪、附睪損傷患者；(3)輸精管發育不良患者；(4)泌尿生殖道感染患者；(5)低促性腺激素性性腺功能減退癥患者。根據精液檢查結果、參照世界衛生組織標準[8]將患者分為無精子組(精子濃度<0.1×106/mL)88例、嚴重少精組(精子濃度<5×106/mL)103例、少精組[精子濃度(5～20)×106/mL]77例。參照不育患者的年齡選取同期體檢正常者100例為對照組(精子濃度大于20×106/mL)，年齡26～45歲。兩組研究對象均簽署檢測研究知情同意書。本研究經我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 AZFc缺失篩查 抽取研究對象外周靜脈血5 mL，分離淋巴細胞，使用全血DNA提取試劑盒[亞能生物技術(深圳)有限公司]提取DNA，儲存于-20℃冰箱備用。采用多重PCR法對序列標簽位點(STS) 進行檢測，分析AZFc缺失情況。設置6個序列標簽位點：SY160(上游5′-TACGGGTCTCGAATGGAATA-3′，下游5′-TCATTGCATTCCTTTCCATT-3′)；SY254(上游5′-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3′，下游5′-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3′)；SY1291(上游5′-TAAAAGGCAGAACTGCCAGG-3′，下游5′-GGGAGAAAAGTTCTGCAACG-3′)；SY1125(上游5′-GTGGGGGTTTCACATTATGG-3′，下游5′-GGTCACAGACTCACATTTAAGCA-3′)；SY1191(上游5′-CCAGACGTTCTACCCTTTCG-3′，下游5′-GAGCCGAGATCCAGTTACCA-3′)；SY1201(上游5′-CCGACTTCCACAATGGCA-3′，下游5′-GGGAGAAAAGTTCTGCAACG-3′)。總反應體系主要包括：緩沖液、引物、dNTP、Taq酶、無核酸水，共25 μL。反應條件：預熱95℃ 3 min，95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環，延伸72℃ 10 min。

1.2.2 DAZ基因拷貝數分析 對AZFc部分缺失患者進一步進行DAZ基因拷貝數檢測。采用PCR-RFLP分析DAZ基因中SNV 5(上游5′-CCTGGAGATTTCTTGTATATGGAA-3′，下游5′-CTTACAAACATTATGCTGAGTGAA-3′)，檢測DAZ 基因拷貝數差異。SNV 5的特定片段分為DAZ1/2與DAZ3/4。另選DAZ基因外Y染色體上M159位點(上游5′-GCTAGTAGTGGTGCTTGATAA-3′，下游5′-TTTAAAAAGTACCAGAAGAAGG-3′)作為內參以消除 DNA 濃度不均產生的影響。

1.3 統計學處理 采用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行分析。計數資料用%描述，組間比較用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不育患者與體檢正常者的AZFc缺失率比較 268例不育患者中，存在AZFc部分缺失78例，缺失率為29.10%，對照組體檢正常者的AZFc缺失率為3.00%。無精子組不育患者的AZFc缺失率明顯高于少精組及對照組，嚴重少精組不育患者的AZFc缺失率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不育患者與體檢正常者的AZFc缺失率比較 [n(%)]

2.2 268例患者STS各序列位點的AZFc缺失分布 檢測分析結果顯示，SY254序列位點的AZFc缺失率最高為34.70%，SY1125序列位點的AZFc缺失率為23.13%，SY160序列位點的AZFc缺失率為16.42%。見表2。

表2 268例患者STS各序列位點的AZFc缺失分布

2.3 AZFc區域DAZ基因拷貝缺失情況比較 對81例AZFc部分缺失者(78例患者，3例體檢正常者)進行 DAZ 基因拷貝缺失分析。結果顯示，DAZ1/2拷貝缺失者有30例，DAZ3/4 拷貝缺失者有55例，部分不育癥患者存在DAZ1/2與DAZ3/4共缺失情況。無精子組、嚴重少精組、少精組、對照組研究對象的DAZ1/2基因拷貝缺失率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；但4組間的DAZ3/4拷貝缺失率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，無精子組、嚴重少精組、少精組患者的DAZ3/4拷貝缺失率均明顯高于對照組 (P<0.05)。見表3。

表3 AZFc區域DAZ基因拷貝缺失情況比較 [n(%)]

3 討 論

男性不育的遺傳因素逐漸受到業內的重視，研究發現，男性Y染色體AZFc缺失是男性生精障礙的重要因素，AZFc中的 DAZ 基因拷貝缺失與男性原發性無精、嚴重少精癥的關系尤為密切[9-10]。對AZFc部分缺失進行檢測有助于對男性原發性無精子癥和嚴重少精子癥患者進行輔助生育精子質量篩選。綜合分析國內外相關研究結果發現，男性原發不育患者AZFc部分缺失的發生率可能與其種族、地域及基因多態性相關。廣西地區男性不育形勢日益嚴峻，對廣西地區男性不育患者AZFc缺失發生率展開調查，可進一步弄清AZFc缺失與男性原發不育癥的關系。

本研究對268例廣西地區不育男性患者進行檢測分析發現，患者的AZFc缺失率為29.10%，少精組、嚴重少精組、無精子組患者的AZFc缺失率依次升高，提示AZFc缺失率越高男性的生精障礙越嚴重。在本研究中，無精子癥患者的AZFc缺失率高達40.91%，嚴重少精癥組患者的AZFc缺失率達26.21%，比既往文獻報道的AZFc缺失率稍高[3,11]，可能與各研究樣本的納入標準、排除標準或患者所在地區不同有關。AZFc與男性生精密切相關的DAZ基因拷貝缺失是AZFc區缺失率高的核酸基礎，本研究所選的STS均為AZFc區常見的序列位點，已覆蓋AZFc區，在男性原發無精子癥及嚴重少精子癥患者輔助生育精子質量篩選與預后評估中，能夠很好地減少因AZFc垂直傳遞帶來的干擾。

男性Y染色體上有兩個呈反向排列的DAZ基因拷貝區，即DAZ1/2與DAZ3/4，二者拷貝數差異可導致不同程度的生精障礙[12]。本研究結果顯示，無精子組、嚴重少精組、少精組、對照組研究對象的DAZ1/2基因拷貝缺失率比較差異無統計學意義，但無精子組、嚴重少精組、少精組患者的DAZ3/4基因拷貝缺失率與對照組比較，差異有統計學意義，提示DAZ3/4基因缺失與男性生精障礙的關系要比DAZ1/2基因缺失與男性生精障礙的關系更為密切。在本研究中，DAZ3/4基因拷貝缺失均出現在無精子癥、嚴重少精子癥及少精癥患者中，而DAZ1/2拷貝缺失則在少精組、正常對照組中發生的概率較高，與既往文獻報道的結果[13-15]存在一定差異，這可能是因研究對象的種族及地域差異所致。導致男性原發性生精障礙發生的遺傳原因有多種，DAZ基因缺失只是其中之一，在一些DAZ基因缺失的生精障礙患者中還可能同時存在基因倒位或重復的情況，需進一步深入研究。

綜上所述，AZFc缺失率越高廣西地區男性生精障礙患者的生精障礙越嚴重，但AZFc部分缺失并不會導致絕對不育，及早檢測AZFc缺失有助于指導患者治療，對優生優育具有重要的意義。