MIF在香煙煙霧誘導的COPD大鼠炎癥進展中的作用研究

鐘 莉, 李天浩, 王惠琴

(陜西中醫藥大學， 陜西 咸陽 712046)

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 是一種常見的，多發的呼吸道慢性疾病,最終發展為肺心病和呼吸衰竭等，可危及患者生命。COPD以持續氣流受阻、進行性發展為特征，炎癥累及氣道、肺實質、肺血管乃至全身,且病情隨著時間的進展不斷地惡化,肺部功能也持續下降；同時，患者一般年齡偏大，機體免疫力急劇下降及各種共患病較多，病情較易反復發作，同時容易發生抑郁、驚恐等精神心理疾病，從而致使患者心理上的不健康和生存質量下降[1]。據2017年疾病負擔報告統計顯示，隨著人口老齡化、慢性病的發病率增加，我國COPD患病率及死亡率逐年上升，現已經成為我國第3大死亡疾病[2]。國內外研究顯示,炎癥機制在COPD的發病機制中起重要作用，包括多種炎癥細胞(如肺泡巨噬細胞、中性粒細胞等)[3]以及炎癥因子(MIF、IL-6等)，但由于大多數患者對皮質類固醇具有抗藥性，導致目前療法治療效果不佳[4]。因此探究COPD炎癥機制對于疾病的治療具有重要意義。巨噬細胞移動抑制因子(MIF)是一種炎癥抑制因子，最初認為是由T細胞介導的抑制巨噬細胞遷移的細胞因子，后來發現其是調節巨噬細胞宿主防御功能的因子，在不同組織中普遍表達具有促炎癥、趨化的主要功能[5]。其表達升高通常與炎癥情況有關，能反應機體炎癥狀態，受體結合研究表明MIF通常處于炎癥級聯的頂端，通過與相應受體(如CD74，CXCR2、CXCR4和CXCR7)結合吸引巨噬細胞及淋巴細胞前往炎癥部位發揮促炎趨化作用。多項研究發現MIF的表達和分泌在多種慢性炎癥性疾病中增加，如敗血癥、關節炎、哮喘，及COPD相關肺癌等[6]。本研究采用香煙煙熏法制備COPD大鼠模型，通過ISO-1阻斷MIF后觀察大鼠不同時間段血清及肺組織的MIF濃度、肺組織MIF的蛋白表達以及血清和肺組織IL-6的變化情況，探討MIF在COPD炎癥發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑

1.1.1實驗動物:SD大鼠60只，雄性，180～200g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為：SCXK(京)2016-0011。經過陜西中醫藥大學倫理委員會審查批準，遵循實驗動物學及相關動物保護法進行實驗。

1.1.2實驗試劑:ISO-1(S7732)(MIF抑制劑)，上海藍木公司；MIF(YX-E21117)、IL-6(YX-E21185)的ELISA KIT，上海優選公司；Anti-MIF antibody(BA2058)，武漢博士德公司；黃果樹牌香煙(焦油量:10mg，煙氣煙堿量:0.9mg，煙氣一氧化碳量:12mg)。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠COPD模型制備:將大鼠隨機分為3組：分別為模型組、ISO-1組和健康對照組。大鼠適應性飼養一周。模型組和ISO-1組SD大鼠采用單純煙熏法使其同時、同條件下被動吸煙90d，每日兩次(早八點、晚六點開始)，每次2h；ISO-1組在煙熏同時分別在第0～30d、60～90d第一次煙熏前1h腹腔注射ISO-1(0.4mg/kg)溶液；健康對照組和模型組給予等量生理鹽水，每日一次。

1.2.2大鼠取材:分別在實驗第30d、60d、90d以10%水合氯醛(0.3mL/100g)經腹腔內注射麻醉大鼠，大鼠腹主動脈采血；取雙肺組織，并將大鼠左肺下葉固定后石蠟包埋，以備進行HE染色和免疫組化實驗，其余部分制備勻漿。

1.2.3酶聯免疫吸附法檢測血清、肺組織勻漿MIF、IL-6濃度:按照ELISA檢測試劑盒說明書流程操作,大鼠血清、肺組織勻漿樣品直接加樣,按程序添加樣本稀釋液、辣根過氧化物酶標記的檢測抗體反應1h，加洗滌液吸板5次,再依次加入底物A、B，避光孵育15min后加入終止液，終止顯色后立即使用酶標儀讀取每孔的吸光度(OD)值。通過軟件獲得標準曲線，計算每個樣本的MIF、IL-6濃度值。

1.2.4肺組織免疫組化分析檢測MIF蛋白表達:石蠟切片常規脫蠟。依次進行抗原修復→血清封閉→滴加一抗→DAB顯色→復染→返藍→梯度酒精脫水→透明封片→通過圖像分析系統觀察分析MIF的蛋白表達位置及平均光密度值。每組內每張切片隨機挑選至少3個200倍視野進行拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，并求出平均光密度值IOD/AREA(Mean Density)。以平均光密度值的均值(AOD)作為該大鼠切片的蛋白表達值。

1.2.5大鼠肺切片HE染色:將固定在4%多聚甲醛溶液中的肺組織取出，進行包埋后制成石蠟切片，再依次進行脫蠟→水化→蘇木素染色→伊紅染色→脫水封片，最后顯微鏡下拍照觀察。

2 結 果

2.1大鼠一般情況:健康對照組組大鼠實驗期間活動飲食均正常，毛發光澤，精神佳，體重增長迅速，無喘息氣促；COPD組大鼠隨著煙熏時間的增長，對外界反應能力逐漸下降，呼吸急促伴喘鳴，毛發光澤感欠佳，毛色枯黃，活動減少，飲食飲水減少，體重增長緩慢；ISO-1組大鼠喘鳴情況較輕，飲食尚可，毛發光澤較好，活動及反應能力逐漸恢復，體重增長較慢。

2.2血清及肺組織勻漿MIF檢測:隨著時間進展模型組血清和肺組織勻漿MIF水平顯示出升高趨勢，同時在不同時間(30d、60d、90d)均較健康對照組和ISO-1組升高(P<0.05)，ISO-1組血清和肺組織勻漿MIF水平均高于健康對照組(P<0.05)。同一時間比較，ISO-1組血清和肺組織勻漿中IL-6水平與模型組相比明顯降低(P<0.05)，與健康健康對照組比較升高(P<0.05)。各時間段健康對照組和ISO-1組大鼠血清和肺組織勻漿MIF水平均無統計學意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 不同時間段各組大鼠肺組織勻漿MIF濃度

表2 不同時間段各組大鼠血清MIF濃度

2.3血清及肺組織勻漿IL-6檢測:模型組血清和肺組織勻漿IL-6水平隨著時間推移(30d、60d和90d)逐漸升高(P<0.05)。ISO-1組血清和肺組織勻漿中IL-6水平與同一時間模型組相比明顯降低(P<0.05)，與健康對照組比較升高(P<0.05)。不同時間段ISO-1組血清和肺組織勻漿IL-6均相比于模型組明顯降低(P<0.05)，均高于健康對照組(P<0.05)。各時間段健康對照組和ISO-1組大鼠血清和肺組織勻漿IL-6水平均無統計學意義(P>0.05)。見表3、表4。

表3 不同時間段各組大鼠肺組織勻漿IL-6濃度

表4 不同時間段各組大鼠血清IL-6濃度

2.4肺組織病理改變:①健康對照組：大鼠肺組織形態正常，肺泡大小正常，充氣狀態良好，肺泡間隔無破壞，支氣管及周圍無黏液及炎細胞浸潤(圖1A)。②COPD模型組：持續香煙煙霧造模30d時，肺組織結構中度異常，支氣管管腔狹窄，部分上皮細胞變性壞死，管腔內可見炎性滲出物，周圍可見大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡融合擴張，形成肺大泡(圖1B)。持續香煙煙霧造模60d時，肺組織結構重度異常，支氣管大量上皮細胞壞死脫落至管腔，平滑肌明顯增厚，周圍可見大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡融合擴張，形成肺大泡，炎癥細胞數量較第一批模型組明顯增加(圖1C)。持續香煙煙霧造模90d時，肺組織結構重度異常，支氣管管腔擴張，并可見大量炎性滲出物及蛋白黏液，可見壞死粒細胞以及泡沫細胞，部分支氣管上皮細胞壞死，周圍可見大量炎癥細胞浸潤，平滑肌增厚，損傷程度較第一批第二批明顯增加(圖1D)。③ISO-1組：給藥30d時，肺組織結構輕度異常，支氣管少量上皮細胞變性，脫落，周圍部分肺泡融合擴張，形成肺大泡，支氣管周圍可見少量炎癥細胞浸潤，數量較模型組明顯減少(圖1E)。給藥60d時，肺組織結構輕度異常，部分支氣管上皮細胞變性脫落，周圍可見少量炎癥細胞浸潤，部分肺泡融合擴張，形成肺大泡，損傷程度較第一批治療組有增加，較第二批模型組明顯改善(圖1F)。給藥90d時，肺組織中度異常，支氣管管腔內可見炎性滲出物，平滑肌明顯增厚，周圍可見大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡融合擴張，形成肺大泡，損傷程度較第三批模型組明顯改善，較第一批第二批治療組明顯增加(圖1G)。

圖1 肺組織病理學改變(HE染色，×200)

2.5免疫組織化學檢測肺組織中MIF的表達:免疫組化結果顯示，隨著時間進展，模型組MIF蛋白表達呈現出升高趨勢，模型組和ISO-1組MIF表達均高于健康對照組，其中模型組較ISO-1組各時間段(除外第30d)的肺組織MIF表達均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，ISO-1組各時間段肺組織MIF表達顯著降低(P<0.05)(圖2)。見表5、圖3。

圖2 MIF平均光密度值(AOD)

表5 不同時間段各組大鼠肺組織MIF蛋白表達AOD值

3 討 論

本研究結果顯示MIF在模型組大鼠中高表達，且隨著病情加重，MIF的表達不斷升高，同時炎癥因子IL-6在模型組血清和肺組織中也高表達，與田王斌等[7]觀點一致。而通過抑制MIF后發現，大鼠不同時間段MIF的表達較單純煙熏的模型組明顯降低，僅高于健康對照組；炎癥因子IL-6與MIF的表達呈現出明顯相關性，研究發現不同時間段ISO-1組IL-6的表達也較單純煙熏的模型組明顯降低，較健康對照組高，表明在COPD的發生發展過程中通過抑制MIF可以抑制其炎癥進展。使用ISO-1可以降低臭氧誘導的皮質醇抵抗COPD小鼠的肺部炎癥，研究一致支持MIF在COPD中具有促炎作用。同時肺組織病理發現ISO-1組不同時間段的肺部炎癥狀態均較模型組輕，特別是相較于模型組90d造模成功后的大鼠模型，其肺部炎性改變明顯緩解。

COPD的特征是中性粒細胞浸潤，小鼠體內低劑量的LPS可誘導富含中性粒細胞的肺部炎癥，這可通過抗MIF抗體預防[8]。Magalhaes及其同事還報告了在OVA哮喘模型中，MIF基因敲除小鼠的AHR對乙酰膽堿的反應降低[9]。本研究進一步支持了ISO-1的抗炎作用，因為本研究使用的是不同的大鼠模型證實。相比之下，其他研究在OVA或LPS處理的小鼠模型中均未顯示ISO-1對炎癥的影響。

抑制MIF的抗炎作用曾在幾種疾病模型中報道過。現已證明抗MIF抗體對內毒血癥、關節炎敗血癥和OVA誘導的過敏性哮喘具有保護作用[10,11]。我們的研究是MIF拮抗劑ISO-1首次在香煙煙熏誘導的的COPD大鼠模型中顯示出抗炎作用，這也提供了新的證據，表明靶向抑制MIF可能是治療該疾病患者的一種有用方法。

本研究尚存在以下不足之處：①沒有收集臨床樣本，缺少臨床研究驗證。②盡管我們證實了ISO-1對于COPD炎癥的影響，但未證明對大鼠模型中其他通氣功能指標的影響。③本研究過程僅使用了雄性大鼠進行研究，未考慮性別因素的影響。

綜上所述，我們探討了MIF在COPD疾病進展中的作用，結果表明其參與COPD發生發展過程，且在一定程度反映大鼠COPD進展中的炎癥狀態，同時COPD炎癥狀態的加重可通過MIF調控來實現，通過ISO-1抑制MIF可減輕香煙煙霧誘導的COPD大鼠肺組織損傷以及炎性因子的表達。因此是否將來可通過靶向抑制MIF來治療COPD患者，緩解患者肺組織損傷及炎癥狀態，這為臨床上治療COPD患者提供了一個新的思路，值得更加深入的探討。