重組變構人TRAIL聯合5-FU對裸鼠結直腸癌移植瘤的抑制作用

孫同友， 趙麗霞， 崔玉潔， 周 碩， 梁秀軍， 孫大永

(1.河北省承德市中心醫院， 河北 承 德 067000 2.河北省人民醫院腫瘤五科， 河北 石家莊 050057 3.承德醫學院研究生院， 河北 承 德 067000 4.承德醫學院基礎醫學研究所， 河北 承 德 067000)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的胃腸道惡性腫瘤，起源于結直腸黏膜上皮，包括結腸和直腸的惡性腫瘤，全球范圍內CRC的發病率和死亡率分別占所有惡性腫瘤發病的第3位和第2位[1]。我國的形勢也很嚴峻，根據國家癌癥中心發布的2015年我國惡性腫瘤流行病學數據，CRC發病占全組人群的第3位，其導致的死亡占第5位，造成了很大的社會經濟負擔[2]。對于局限性疾病，手術、放療和化療等標準治療手段的療效尚可[3]，盡管如此，最終40%以上的患者會出現遠處轉移，目前手段對轉移性CRC的治療仍然具有挑戰性。在過去幾十年里，細胞毒性藥物聯合化療一直是治療晚期CRC的主要措施，為了尋求突破，人們通過化療聯合生物靶向藥物來提高總生存率(overall survival,OS)，盡管如此，晚期CRC的5年生存率仍然相對較低，僅為14%左右，與局部區域性CRC相比，其平均OS約為30個月，療效不能令人滿意[4]。因此，探索新的針對晚期CRC的有效藥物及治療手段顯得尤為重要。rmhTRAIL(CPT)是野生型TRAIL環化變構而來，其在安全性、穩定性、溶解性及抗癌生物活性方面都表現的更佳[5]。課題組前期體外研究結果顯示CPT單藥及其與5-FU聯用對CRC細胞增殖有明顯抑制作用，并能誘導細胞凋亡[5]。實驗動物模型是體外細胞實驗結果向體內研究結果轉化的橋梁，在癌癥發生機制及藥理學研究中都發揮著關鍵作用。皮下接種異位移植瘤模型因為其操作簡單、成瘤率高及腫瘤生長快等特點，是人類研究癌癥過程中最常使用的方法之一[6]。故本實驗選擇6周齡雌性BALB/c裸鼠，建立人CRC皮下移植瘤模型，研究CPT單藥及其與5-FU聯合對裸鼠皮下移植瘤的抑制作用，以期為今后臨床應用CPT治療結直腸癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實驗細胞和實驗動物:人CRC HCT116細胞株由聯勤保障部隊第九八〇醫院腫瘤科實驗室惠贈；體重18-22g的BALB/c裸鼠，6周齡、雌性，由北京維通利華實驗動物技術有限公司購買，動物許可證為SCXK(京)2016-0011。SPF級的實驗動物飼養于恒定溫度和濕度的環境中，飼料及飲水均經滅菌處理，一籠5只裸鼠，每日光照12h。

1.1.2主要試劑:CPT由北京沙東生物公司饋贈；氟尿嘧啶注射液由上海旭東海普藥業有限公司生產；1640培養液(Gibco)、PBS緩沖液(HyClone)；FBS(胎牛血清，Gibco)、0.25%含EDTA胰酶(Sigma)；TUNEL(羅氏公司)、DAPI(上海碧云天公司)、異氟烷(上海雅培制藥有限公司)、激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)、OCT冰凍切片包埋劑(美國SAKURA公司)、電子游標卡尺(美國Fisher公司)、手術器械(美國Fisher公司)。

1.2方 法

1.2.1細胞培養及建立裸鼠移植瘤模型:人CRC細胞HCT116培養于RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清)中，并置于5% CO2、37℃及飽和濕度的培養箱內，每天換液1次，用胰蛋白酶溶液消化細胞傳代。將HCT116細胞制成單細胞懸液，用細胞計數板計數，測得細胞懸液密度為5×107個/mL，于25只裸鼠右側腋窩中部外側皮下分別注射單細胞懸液120μL。

1.2.2實驗動物分組及給藥:自接種之日起，每隔1d觀察裸鼠右側腋窩接種部位皮下成瘤情況，利用游標卡尺測量裸鼠結直腸癌移植瘤的長短徑，并根據公式算出腫瘤體積，公式：腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2。實驗分組：待皮下移植瘤大小至100-120mm3時，將25只裸鼠隨機分為5組，每組5只：對照組，5-FU組，CPT組，CPT低劑量聯合5-FU組及CPT高劑量組聯合5-FU組，每組5只。治療劑量及方法：對照組注射生理鹽水；5-FU組每次的劑量為每只5mg/kg，采取尾靜脈注射的方式；CPT單藥組的劑量為每次每只7.5mg/kg，以腹腔注射的方式給藥；CPT聯合5-FU組，5-FU給藥劑量及方式同前，CPT腹腔注射劑量為每次每只2.5mg/kg或7.5mg/kg，兩藥給藥間隔時間為4h。每2d注射一次，一共給藥10次。基于預實驗結果及既往文獻報道選擇給藥劑量以及給藥方式[7]。

1.2.3觀察實驗動物的一般情況、測量體重及腫瘤長短徑:自用藥當天開始，每天觀察并記錄動物的精神、活動、飲食、飲水等一般表現，并觀察皮下移植瘤有無紅腫破潰；裸鼠體重每5d測量1次、并測量皮下移植瘤的長短徑。所有動物均在用藥第25天采用頸椎脫臼法迅速處死，剝離腫瘤，測量大小，稱量瘤重，拍攝照片，根據公式算出第25天時的移植瘤腫瘤抑制率和體積抑制率。腫瘤抑制率=(1-實驗組瘤重/對照組瘤重)×100%；腫瘤體積抑制率=(1-實驗組瘤體積/對照組瘤體積)×100%。

1.2.4TUNEL/DAPI雙染檢測細胞凋亡:將剝除的移植瘤組織用冰凍切片機制成冰凍切片，切片的厚度3μm。按TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶“dUTP”介導的dUTP缺口末端標記法)/DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)試劑盒操作說明檢測細胞凋亡：4%多聚甲醛常溫固定切片20min，用PBS漂洗30min，細胞通透液破膜通透2min，PBS漂洗后加TUNEL反應混合液(TdT+熒光素標記的dUTP)避光孵育60min，加DAPI避光孵育5min，PBS漂洗3次后用甘油封片，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況，于400倍視野下計數凋亡細胞數，并拍照。

2 結 果

2.1CPT和5-FU對實驗動物生活狀態的影響:在研究進程中，給藥后實驗動物均一般情況良好，未出現精神萎靡、行動遲緩、不思飲食等情況；移植瘤表面未見出血及壞死，每組裸鼠均未見死亡發生。統計顯示，藥物對裸鼠體重的影響無統計學意義(F藥物=0.174，P=0.949)，時間對裸鼠體重的影響有統計學意義(F時間=150.864，P<0.001)，分組和時間對動物體重影響的交互作用有統計學意義(F交互=24.648，P<0.001)。從實驗開始到第10天各組動物體重逐漸增大，而從第10天到實驗結束，只有對照組和CPT組動物體重小幅上升，其它組動物體重逐漸減小。見圖1。

圖1 CPT與5-FU聯用對實驗動物體重的影響

2.2CPT聯合5-FU對裸鼠皮下移植瘤的生長抑制作用:人CRC裸鼠皮下移植瘤模型構建成功，重復測量的方差分析結果顯示：時間和藥物之間具有交互效應(F交互=118.779，P<0.001)，且藥物和時間對裸鼠皮下移植瘤的影響均有統計學意義(F分組=249.381，P<0.001；F時間=1577.999，P<0.001)，皮下移植瘤體積隨著時間的延長而逐漸增大，與其它組比較，高劑量CPT聯合5-FU組移植瘤體積增大最為遲緩(P<0.01)。在各時間點與對照組比較，單用CPT或5-FU均能抑制裸鼠人CRC皮下移植瘤生長(P<0.01)；當CPT與5-FU聯合時，抑制人CRC皮下移植瘤的生長作用愈加顯著，且以高劑量CPT(7.5mg/kg)聯合5-FU組最為明顯，與其它組比較差異有統計學意義(P<0.01)，聯合組之間比較差異也有統計學意義(P<0.01)。實驗結束時，以對照組裸鼠移植瘤體積最大，而高劑量CPT聯合5-FU組的腫瘤體積最小。見圖2和表1。剝取腫瘤稱量瘤重，統計顯示：各組間差異具有統計學意義(F=38.112,P<0.001)，對照組腫瘤質量最大，單藥5-FU及CPT組的瘤重與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，但兩單藥組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)；聯合組與單藥組及對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)，而兩聯合組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖2 CPT聯合5-FU對皮下移植瘤體積的影響

圖3 CPT聯合5-FU對皮下移植瘤的生長抑制作用

圖4 CPT聯合5-FU對皮下移植瘤重量的影響

表1 實驗結束時裸鼠移植瘤體積及抑瘤率

表2 裸鼠移植瘤質重及瘤重抑制率

2.3CPT聯合5-FU對人CRC裸鼠皮下移植瘤細胞凋亡的影響：激光共聚焦顯微鏡掃描顯示TUNEL/DAPI染色后CPT聯合5-FU治療的裸鼠腫瘤細胞呈綠色熒光，而未經治療的對照組或單藥CPT及5-FU組治療的裸鼠腫瘤細胞沒有顯示明顯的綠色熒光，表明CPT與5-FU聯用誘導裸鼠皮下移植瘤細胞發生了凋亡；對凋亡腫瘤細胞數進行計數，統計顯示：各組間均數差異具有統計學意義(F=201.784,P<0.001)，其它組與對照組比較均有統計學意義(P<0.001)，聯合組與兩單藥組相比差異也有統計學意義(P<0.05)，聯合組之間比較差異也有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表3。

圖5 CPT聯合5-FU對皮下植瘤細胞凋亡的影響

表3 腫瘤凋亡細胞數

3 討 論

隨著分子生物學和分子診斷技術的迅速發展，科學家們認識到癌癥發生不僅涉及細胞凋亡通路受阻、細胞信號轉導通路異常，還可由一種或多種抑癌基因失活或原癌基因激活所引起，是一個多步驟多階段的復雜過程。CRC發生的危險因素主要包括遺傳易感性、表觀遺傳學改變、飲酒、高脂肪飲食、缺乏運動以及腸道黏膜的慢性炎癥等[8]。從結腸腺瘤發展到CRC涉及到多個基因的缺失或突變，包括APC基因缺失、RAS癌基因突變以及抑癌基因DCC和p53的缺失等[9]。基于對癌癥發病機制的深入認識，針對癌癥發生發展的某個或某些靶點進行精準打擊的靶向治療在惡性腫瘤治療中取得了很大進展，而在CRC中以靶向抗腫瘤血管生成治療藥物進展最為迅速，這類藥物主要包括針對血管內皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)的大分子單抗以及血管內皮生長因子受體(VEGFR)的小分子酪氨酸激酶抑制劑(VEGFR-TKIs)[10]。雖然靶向抗腫瘤血管生成藥物在CRC治療中取得了一定療效，但是由于缺乏有效且可靠的預測療效的標志物以及獲得性耐藥等問題，總體療效仍不盡如人意。近幾年，免疫治療藥物異軍突起，給腫瘤病人帶來了新的希望和治療選擇。在有高度微衛星不穩定/錯配修復功能缺陷(MSI-H/dMMR)的轉移性結直腸癌(metastatic Colorectal Cancer，mCRC)中，免疫治療的療效較傳統治療手段顯著提高[11]，但是，只有5%左右的mCRC患者伴有MSI-H/dMMR，而不具備MSI-H/dMMR的mCRC對免疫治療的反應性較差。

TRAIL不同于傳統的化療藥物，也不同于靶向以及免疫治療藥物，它能靶向性的殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有毒性，這使它成為被寄予厚望的抗癌明星因子。CPT是由TRAIL環化變構后得到，其在穩定性、半衰期及抗癌活性等方面均強于TRAIL。我們第一次報道了CPT單藥及其聯合5-FU在體外能抑制CRC細胞的增殖并能誘導其凋亡。嚙齒動物在生理功能和結構方面與人類相似，被認為是研究CRC良好的模型。將細胞懸液注射于BALB/C裸鼠腋下建立了CRC移植瘤模型，來評價藥物的抗腫瘤活性。在本研究中，我們也成功構建了人CRC裸鼠皮下移植瘤模型，并應用CPT聯合5-FU的方案治療，觀察體內抗腫瘤效果，5-FU的用量為5mg/kg，遠低于臨床常用劑量，且明顯低于其它實驗中的用量[12,13]。結果顯示：各組實驗動物對治療方案耐受性良好，未出現拒食、死亡等情況，各組動物在體重上未見明顯差異。單藥CPT或CPT聯合5-FU均能抑制CRC移植瘤生長；繪制移植瘤生長體積曲線顯示與對照組相比，治療組移植瘤的生長速度明顯較慢，且以高劑量CPT與5-FU聯合組移植瘤的生長最慢；稱量裸鼠移植瘤的瘤重，結果顯示聯合治療組裸鼠移植瘤的瘤重明顯低于對照組及單藥組，并且以7.5mg/kg的CPT聯合5-FU組瘤重減輕最顯著，這表明高濃度CPT有更強的抑制裸鼠移植瘤生長作用，與體外實驗結果一致。

本研究應用TUNEL/DAPI染色法檢測移植瘤細胞凋亡情況，結果顯示CPT、5-FU及兩者聯合治療也引起了移植瘤細胞凋亡，激光掃描共聚焦顯微鏡下可見代表細胞凋亡的綠色熒光，以大劑量CPT聯合5-FU引起的裸鼠移植瘤細胞凋亡最明顯，且與其它組比較具有統計學意義(P<0.001)，這與體外實驗結果一致。而兩單藥組之間相比細胞凋亡沒有顯著差異，考慮主要與用藥劑量較小及機體復雜代謝環境等因素有關。本研究首次探討CPT聯用5-FU對CRC的治療作用，有很多方面需要總結和完善，比如選擇不同的CRC細胞系、嘗試多種劑量組合方案、對移植瘤組織中凋亡通路有關分子進行檢測等。

綜上，本研究結果表明CPT單藥及其與5-FU聯合治療CRC在體內也展示出了良好的抗腫瘤活性，且對實驗動物無明顯毒性。這為深入探索CPT聯合5-FU治療CRC提供了實驗基礎。