ＨＰＬＣ法測定麗江山慈菇中秋水仙堿含量

黃云先 劉云懷 楊光榮

【摘要】目的：建立高效液相色譜法（HPLC）測定麗江山慈菇中秋水仙堿的含量。方法：采用OmniGeneLLC生廠的HPLCColumnHubbleC18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱;以甲醇-水（60∶40）為流動相;檢測波長為254nm;流速為1.0mL·min-1，柱溫為30℃。結(jié)果：在建立的含量測定HPLC條件下，秋水仙堿在26.133～522.660μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好，r=0.9997;平均回收率為99.91%，RSD=2.14%（n=9）。結(jié)論：本法簡便、快捷，準確度高，專屬性強，重復性好，可用于麗江山慈菇藥材的含量測定及質(zhì)量控制。

【關鍵詞】麗江山慈菇;質(zhì)量控制;高效液相色譜法;秋水仙堿;含量測定

【中圖分類號】R284.1【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2022）11-0019-03

麗江山慈菇是百合科植物山慈菇IphigeniaindicaKunth的鱗莖[1]，又名山慈菇、土貝母、草貝母、假貝母、鬧狗藥[2]、苦子、光苦子、益辟堅[3]、光慈菇[4]如圖1所示。云南省地方習用藥材，為納西族、白族、彝族常用藥材。載于《本草遺拾》，為《云南省藥品標準》（1974年版、1996年版）、《云南省中藥材標準》2005年版第二冊·彝族藥收載品種。與《中國藥典》2015年版一部收載“山慈菇”比較，來源系不同科屬植物，為與國家標準相區(qū)別，謂之“麗江山慈菇”，是云南產(chǎn)中成藥的“乳癖清膠囊（國藥準字Z20025068）”的原料藥之一。麗江山慈菇還是提制秋水仙堿的主要原料。《云南省中藥材標準》2005年版第二冊·彝族藥中對麗江山慈菇的性狀、鑒別、水分、酸不溶性灰分、浸出物有明確規(guī)定，但對其含量卻沒有測定方法，本文參照文獻[5-6]，通過對云南省麗江古城區(qū)和玉龍縣及大理4個批次的麗江山慈菇樣品進行了秋水仙堿的含量測定，以建立一個合理的測定方法，從而達到控制麗江山慈菇藥材質(zhì)量的目的。

1儀器與試藥

安捷倫1260型高效液相色譜儀[二極管陣列檢測器，安捷倫（中國）科技有限公司];HubbleC18柱（250mm×4.6mm，5μm，OmniGeneLLC）;BT224S電子分析天平（德國塞多利斯）;MS205DU電子分析天平（梅特勒Pur）;elabFlex超純水機（英國ELGE）。

秋水仙堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101176-201202，按93.6%計）;乙腈、甲醇[色譜純，美國塞默飛世爾科技（中國）有限公司];磷酸（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）;水（實驗室自制UP水，Ω=18.3）。麗江山慈菇樣品購買、采集麗江古城區(qū)、玉龍縣及大理樣品共4個：L01，2015年8月，采自麗江市玉龍縣龍蟠鄉(xiāng)新文村，野生品，干燥花期全株;L02，2015年9月，采自麗江市古城區(qū)金山鄉(xiāng)東河村，野生品，干燥果期全株;L03，2015年9月，購自麗江市古城區(qū)象山市場，為大理州鶴慶縣野生品，干燥藥材球莖;L04，2015年10月，購自麗江市玉龍縣龍蟠鄉(xiāng)新文村藥農(nóng)嚴四軍，為其采挖的當?shù)匾吧罚稍锼幉那蚯o。

2方法與結(jié)果

2.1色譜柱與系統(tǒng)適用性試驗譜柱：HubbleC18（250mm×4.6mm，5μm）;甲醇-水（60∶40）為流動相，流速為1.0mL·min-1，進樣量為10μL，檢測波長為254nm，柱溫為30℃。理論板數(shù)按麗江山慈菇峰計不低于3000。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液取秋水仙堿對照品適量，加甲醇稀釋至刻度，制成每1mL含26.133μg的溶液，作為對照品液。色譜圖如圖2所示。

2.2.2供試品溶液取麗江山慈菇粉末（過四號篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25mL，稱定重量。超聲（500W，40kHz）處理30min，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補足減失重量。濾過，濾液作為樣品溶液。如圖3所示。

2.3線性關系取秋水仙堿對照品13.96mg，精密稱定，加甲醇制成每1mL含26.133、52.266、104.530、156.800、209.060、261.330、522.660μg的一系列的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定其峰面積，以對照品的濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，按外標法進行線性回歸，線性方程為Y=42.65537X-149.68159，r=0.9997。說明秋水仙堿在26.133～522.660μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4精密度試驗取26.133μg·mL-1秋水仙堿對照品溶液10μL，在上述色譜條件下，重復進樣6次，測定其峰面積的RSD為0.3%（n=6），表明該系統(tǒng)的精密度良好。

2.5重復性試驗取供試品溶液L01-1，按上述方法連續(xù)測定8次，測得峰面積RSD為0.6%（n=8），表明供試品溶液重復性較好。

2.6穩(wěn)定性試驗取供試品溶液L01-1，按含量測定方法測定9次，每次間隔約8h，測得峰面積的RSD為1.1%（n=9），表明供試品溶液在72h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7回收率試驗精密量取線性關系考察中儲備液1mL至10mL量瓶中、3mL至25mL量瓶中1mL至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成含33.480、40.176、50.220μg·mL-1的對照品溶液。分別取以上3個濃度秋水仙堿對照品以1∶1的比例加入已知含量L01-1、L01-2、L01-3中，按前述色譜條件測定。回收率分別為96.7%，99.8%，102.3%，98.4%，98.7%，100.5%，99.3%，103.9%，99.6%，RSD=2.1%（n=9）。

2.8樣品含量測定取26.133μg·mL-1的秋水仙堿對照品及各樣品按“2.2.2”方法制備的供試品溶液，進行測定，按外標法計算麗江山慈菇中秋水仙堿的含量。同一樣品平行測定2次，結(jié)果見表1。

3討論

3.1檢測波長的選定以二極管陣列檢測器進行全波長190～400nm掃描，秋水仙堿對照品在254nm、353nm處有最大吸收，經(jīng)試驗確定采用254nm作為檢測波長。理論板數(shù)按秋水仙堿峰計算不低于3000。

3.2流動相的選擇篩選了乙腈-甲醇（40∶60）、甲醇-水（55∶45）（60∶40）（65∶35）、甲醇-0.2%磷酸溶液（60∶40）（40∶60）六組流動相進行考察，結(jié)果甲醇-水（60：40）分離效果好，峰形良好，且保留時間適中，故確定上述流動相系統(tǒng)為本法的流動相。

3.3樣品提取溶劑選擇取本品粉末（過四號篩）0.5g或1g，篩選了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇超聲（500W，40kHz）處理30min、1h、2h或加熱回流30min的方法分別進行樣品提取，通過考察，取樣品0.5g與1g，樣品1g峰面積較好且穩(wěn)定;加熱回流30min與超聲（500W，40kHz）處理30min結(jié)果相差不大;提取時間30min與1h、2h后，提取率幾乎不變;使用50%的甲醇超聲處理30min提取效率最高。故確定樣品提取方法為取本品粉末（過四號篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25mL，稱定重量。超聲（500W，40kHz）處理30min，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補足減失重量。濾過，濾液作為供試品溶液。此方法提取效率最高，且操作簡便。

4結(jié)論

不同地區(qū)麗江山慈菇譜圖略有不同，但秋水仙堿確實都存在，可見以秋水仙堿作為麗江山慈菇藥材標識性成分有其合理性。且本法簡便、快捷，準確度高，專屬性強，重復性好，填補了以往麗江山慈菇含量測定的空白，可用于麗江山慈菇藥材的含量測定及質(zhì)量控制。經(jīng)試驗驗證，新擬HPLC法可行。按實際測得含量值，建議定麗江山慈菇按干燥品計，含秋水仙堿（C22H25NO6）不得少于0.12%。

參考文獻

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[3]王國強.全國中草藥匯編（卷二）[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：543.

[4]有毒中草藥大辭典編輯委員會.有毒中草藥大辭典[M].天津：天津科技翻譯出版公司，1991：265.

[5]國家藥典委員會.中國藥典（四部0502）[S].2020年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：57-58.

[6]錢斌，楊龍，李雪松，等.秋水仙堿的含量測定方法[J].中國藥業(yè)，2009，18（6）：59.

（收稿日期：2021-10-11編輯：陶希睿）

作者簡介：黃云先（1997-），女，漢族，本科，副主任藥師，研究方向為食品藥品檢驗檢測，中成藥、中藥材（飲片）標準質(zhì)量研究提高，藥品質(zhì)量評價性探究。E-mail：495659146@qq.com