玉米中赭曲霉毒素A的輻照降解及輻解產物的毒性評價

唐洪濤　夏蕊　遲蕾　劉銳　李詠富

摘要：目的：評價γ射線對赭曲霉毒素A降解的影響和輻射分解產物的特性。方法：對甲醇水溶液中的赭曲霉毒素A（OTA）進行60Coγ射線輻照處理。結果：γ射線能有效地降解水溶液中的OTA，并可以檢測出4種主要的輻解產物。在4 kGy的輻照劑量下，OTA（200 ng/mL）的輻照降解效率可達90%。一種輻解產物毒性低于OTA，其余產物均無毒性記錄。 OTA可影響小鼠的生長狀態，如體重增加和食物利用率，OTA的輻射降解產物大多不產生影響。本研究中，OTA可破壞小鼠血小板和淋巴細胞，增加小鼠血清AST、GLU、BUN，降低LDH。小鼠的某些內臟可被OTA破壞，如肝、腎、肺等，但OTA輻解產物對所有臟器均無影響。結論：OTA對小鼠有毒性作用，OTA降解的輻解產物無明顯毒性作用。

關鍵詞：赭曲霉毒素A;輻照;輻照產物;降解;毒性赭曲霉毒素A（OTA）是由赭曲霉和青霉產生的一種有毒代謝產物，玉米、小麥等農產品較易受到污染。OTA的毒性主要有腎臟毒、肝毒等，并與一種致命的地方性腎臟疾病（巴爾干地方腎病）有關[1]。此外，Reinhard等[25]通過動物實驗研究發現，OTA對動物具有致癌和致畸作用，國際癌癥研究機構已將OTA列為2B類人腎致癌物[6]。JECFA規定OTA在人體中的最大耐受劑量為100 ng/kg[7]。有效降解玉米中赭曲霉毒素A，對于保障食品安全及人體健康具有重要研究意義。食品輻照是一種新型的綠色保鮮技術，長期以來被實踐證明是一種有效的無污染食品保鮮方法[89]。在所有毒素降解方法中，γ射線降解具有許多其他方法無法比擬的優點，廣泛應用于毒素的降解[10]。目前，對OTA的輻解產物及其毒性的研究還沒有定論。針對食品成分復雜的特點，本研究設計了以水為基質的實驗，研究了γ射線對OTA的降解效果，并對輻照產物進行了分析。由于玉米基質的復雜性，對輻解產物的結構分析比較困難，本實驗通過毒理學實驗對OTA及其輻照產物的毒性進行了研究，從而闡明輻解產物的安全性，分析降解產物對小鼠的毒性作用。本研究綜合考慮玉米貯藏過程中OTA的實際污染狀況、輻照降解情況及保證輻照后不引起玉米營養品質的變化，在毒理學實驗中OTA濃度選擇40 μg/kg，輻照劑量選擇10 kGy。

1材料與方法

1.1材料與試劑

赭曲霉毒素A（OTA，純度>98%），購自Fermentek公司;甲醇（色譜純），購自Sigma公司;Balb/c小鼠：重量為（25±2）g，購自軍事醫學科學院。

1.2標準溶液濃度的制備

為進行降解效果實驗，將1 mg OTA溶于100 mL甲醇中，經梯度稀釋制成500、200、100、50、10、5、1 ng/mL標準液（稀釋液為6：4體積甲醇水）。對于輻解產物實驗，在10 mL甲醇中溶解1 mg OTA制備標準溶液，然后稀釋成50 μg/mL 標準液（稀釋液為6：4體積甲醇水）。

1.3γ射線輻照處理

在降解率實驗中，OTA溶液（200 ng/mL）裝于密封的玻璃離心管中，在室溫下輻照，輻照劑量為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 kGy。輻照處理地點在北京大學輻照中心，劑量率為0.31 Gy/s，實際吸收劑量用重鉻酸銀（Ag2Cr2O7）測定計算得到。降解效率（η，%）根據式（1）計算[11]。

（1）

式（1）中，η是降解效率 （%）、Q0是樣品的初始濃度 （mg/L）、Qt是輻照后樣品的濃度（mg/L）。

色譜條件：HPLCFLD系統（Agilent1100系列，美國），ORBAXSBAQ柱（2.1 mm×3.5 μm×100 mm，流動相為V（甲醇）：V（水）：V（甲酸）=60∶40∶0.1，流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量5.0 μL，熒光檢測器激發波長333 nm，發射波長477 nm。標準溶液曲線揭示了峰面積和OTA濃度的線性關系，線性方程為y=2 011.8x-2 730.6（R2=0.999 8），其中x是OTA的濃度、y是色譜峰面積。 檢出限為0.6 μg/mL。 所有樣品進行三平行實驗。

1.4OTA輻解產物

對于輻解產物實驗，在室溫下用10 kGy的劑量對密封在玻璃離心管中的OTA溶液（50 μg/mL進行輻照。采用高效液相色譜法（Agilent1100系列，美國），配備ESIQTOFMS檢測器（Agilent 6510，美國），對放射性產物進行分析。

1.4.1LC系統運行條件色譜柱為ZORBAX Eclipse PlusC18（2.1 mm×3.5 μm×100 mm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A相）和乙腈（B相）。在10 min內，乙腈（B相）從5%變為90%，并保持2.1 min;然后在5.9 min的時間內，乙腈（B相）從90%變為5%，分析終止時間為18 min、進樣量為20 μL、流速為0.3 mL/min。

1.4.2質量系統的運行條件離子源為ESI、離子噴霧電壓為3 800 V、干燥氣體溫度為350 ℃、干燥氣體流速為10.0 L/min、霧化氣體為N2、極性選擇為正、霧化壓力為40.0 psig、碰撞能量為15 eV[12]。

1.5體內毒性研究

所有動物都被保存在無病原體的環境中，并按實驗要求喂食。照料和使用動物的程序得到了綜合農村發展中心倫理委員會的批準，并遵循了所有有關動物倫理使用的條例。將小鼠分為3組，分別為對照組，輻解產物組和OTA組。每組10只小鼠，適應期1周。實驗周期持續90天。在此期間，動物自由飲食和飲水。對照組小鼠采用正常飼料喂養;輻照產物組用輻照玉米添加1/4的專用飼料喂養小鼠;OTA組用未經輻照處理玉米添加1/4的專用飼料喂養小鼠。在飼養期間，每天觀察記錄小鼠的狀態和實驗指標。

食物攝入量=添加量-殘留量（2）

食物利用效率=一定時間內的體重增加量/一定時間內的攝食量*100（3）

血液指標檢測實驗結束時，禁食12 h，所有動物均從眼眶采血，置入抗凝管，然后電擊，防止凝血，檢測全血細胞計數。盡可能多的采集血液，在無菌離心管中采血，放置30 min后加入低速離心機，以3 000 r/min離心10 min，取血清，檢測血液生化指標（ALT、AST、TP、ALB、GLB、CREA、GLU、BUN、CHOL、TGB、LDH）。使用Windows的統計分析SPSS版本11.5來評估數據。 數據采用方差分析檢驗進行統計分析。數據以平均值±標準差表示。

2結果與分析

2.1γ射線對水溶液中OTA降解的影響

根據色譜峰面積，計算不同輻照劑量下OTA的降解率η。 在不同的γ輻照劑量下，OTA具有顯著的降解應（圖1）。當輻照劑量低于1.0 kGy時，降解率要低得多，因為在低照射劑量下沒有足夠的自由基產生。 隨著輻照劑量的增加，降解率也隨之提高。在4 kGy的劑量下，降解率可達90%，然后趨于穩定，這一現象在以往關于輻照誘導脫氫乙酸鈉在水溶液中降解的研究中也有發現[1314]。

2.2輻照產物質譜分析

通過數據庫檢索輻射分解產物的可能的化學結構。 當匹配分數達到90%時，該分子一般視為降解產物。此外，它還可以在5 mg/L的質量范圍內提供質量精度。然后根據碎片信息和OTA裂解過程推導出產物結構。LC/TOFMS對4種主要輻解產物的準確信息如表1所示。輻照前后，OTA及輻照后OTA降解產物的總離子色譜圖（TIC）通過LC/TOFMS獲得（圖2）。消除雜質和對照，LC/TOFMS共檢測4個降解產物，然后分別提取每個峰的二級質譜信息，獲得相關離子碎片信息，并對輻解產物的化學結構進行解析。 首先，甲醇水溶液在輻照的過程中會產生羥基自由基（OH）和甲基自由基（CH3），OTA分子結構中的酰胺鍵在羥基自由基（OH）的作用下裂解，形成降解產物A（苯基丙氨酸）和降解產物B（8羥基3，4二甲基1戊內酯7羧酸），降解產物分子結構如圖2B和圖2C所示;此外，羥基自由基（OH）和甲基自由基（CH3）會同OTA分子發生加成反應，羥基自由基（OH）和甲基自由基（CH3）分別到OTA內酯環，形成新的化合物C（5氯8羥基3，4二甲基1戊內酯7羰基苯基丙氨酸）和D（5氯4，8二羥基3甲基7羰基苯基丙氨酸），其分子結構如圖2D和圖2E所示。

2.3玉米中OTA和輻解產物對小鼠體重的影響

攝入OTA后，小鼠會出現中毒癥狀，如嗜睡、乏力等。 增重和飼料效率的變化將有助于我們研究OTA對其他方面的損害。 研究表明，高濃度真菌毒素污染可導致動物采食量顯著降低，影響飼料利用率和體重增加。表2表明，玉米中OTA和輻射分解產物對小鼠體重增加的影響。 在實驗中，對照組和輻照組的小鼠精神和活動無異常，無死亡。 然而，在OTA組，6周后，小鼠移動緩慢，1只在9周后死亡。 前5周無顯著性差異（P>0.05），后續時間OTA組與對照組和輻照組比較有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。對照組和輻照組，除第6 w外無顯著差異（P>0.05），這是由于OTA在10 kGy劑量下未完全降解所致，因此無統計學意義。表3表明，玉米中OTA和輻射分解產物對小鼠飼料效率的影響。與對照組相比，OTA組和降解產物組小鼠的飼料效率沒有顯著差異（P>0.05）。 從第3周開始，OTA組開始出現顯著差異（P<0.05或P<0.01）。 對照和降解產物組除第5周外無顯著性差異（P>0.05），這是由于OTA在10 kGy劑量下沒有完全降解，因此沒有統計學意義。研究表明，OTA對小鼠有一定的損傷，而降解產物對小鼠的毒性較小。本研究結果與遲蕾實驗[12]的結果一致。

2.4玉米中OTA和輻解產物對小鼠血液常規指標的影響

表4顯示了玉米中OTA和輻解產物對小鼠血液生化參數的影響。 尿氮是腎功能的指標，在嚴重的腎臟損害中會顯著增加[15]。 本研究中，OTA組的尿氮水平明顯高于其他2組，表明OTA可損傷腎臟。 谷草轉氨酶和丙氨酸轉氨酶是肝功能指標[16]。 在OTA組中，谷草轉氨酶的顯著增加表明OTA破壞了肝臟，結論與Malekinejad的研究一致[17]。 然而，輻射分解產物對腎臟和肝臟的危害較小。乳酸脫氧酶是一種能催化乳酸生成丙酮酸的酶，幾乎存在于血液中的所有組織中。在OTA組中，乳酸脫氧酶水平顯著降低，導致代謝異常[12，18]。同時，OTA使神經系統紊亂導致血糖水平升高。 我們的結果與Stoycho實驗[19]的結果一致。

表5顯示了玉米中OTA和輻解產物對小鼠血液常規指標的影響。OTA組的血小板水平顯著低于對照組和輻照降解組，而淋巴細胞水平顯著高于對照組和輻照降解組。 血小板的主要作用是促進止血和加速凝血，維持毛細血管壁的完整性。研究表明，OTA可誘導淋巴細胞增高，但目前尚未有相關解釋。我們推測原因主要是OTA引起的炎癥反應。同時OTA可改變紅細胞和白細胞水平，其結論存在一定差異，其原因是劑量效應。而輻解產物組與對照組無差異。

3討論

在不同的γ輻照劑量下，OTA具有顯著的降解效應，在本研究中，在10 kg計量輻照下，OTA的降解效率可超過90%。OTA 經輻照降解后，可產生4種不同的輻解產物，經質譜儀分析確定降解產物為苯基丙氨酸、8羥基3，4二甲基1戊內酯7羧酸、5氯8羥基3，4二甲基1戊內酯7羰基苯基丙氨酸和5氯4，8二羥基3甲基7羰基苯基丙氨酸。經過動物實驗，可進一步確認OTA對小鼠的體重及其他血液指標的損害，而輻照分解產物則無相應毒性，對腎臟和肝臟的危害也較小。輻照處理可以有效降解OTA，并降低其生物毒性，是降低污染玉米中赭曲霉毒素A的有效手段。參考文獻

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Irradiation Degradation of Ochratoxin A and Toxicity Assessment of Radiolysis Products in MaizeTANG Hongtao1，XIA Rui 1，CHI Lei 2，LIU Rui 3，LI Yongfu 4

（1National Center for Child Nutriment Quality Supervision and Testing，Beijing 100035，China;2 Beijing Chemical Industry Press，

Beijing 100011，China;3Institute of Food and Nutrition Development，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China;

4Integrated Rural Development Center，Guizhou Provincial Academy of Agricultural Science，Guiyang 550006，China）Abstract：Objective To evaluate the effects of γrays on degradation and the characteristics of radiolysis products.Method Ochratoxin A （OTA）in aqueous solution was irradiated by 60Coγ ray.Result OTA in aqueous solution can be degradated by γrays effectively and four main radiolysis products were determined.At the dose of 4 kGy，the irradiation degradation efficiency of OTA （200 ng/mL）was up to 90%.The toxicity of one of radiolysis products was lower than OTA，and the others were no toxic records.OTA can affect the growth status of mice，such as weight gain and food utilization，and most the radiolysis products of OTA brought out no effects.In this animal experiment，OTA can destroy platelets and lymphocytes，increase ast，Glu，bun and decrease LDH.Some viscera of mice could be destroyed by OTA，such as liver，kidney，lung，etc，but the radiolysis products of OTA had no effect on all viscera.Conclusion OTA has toxic effect on mice，but the radiolysis products degraded by OTA have no obvious toxic effect.

Keywords：Ochratoxin A;irradiation;radiolysis products;degradation;toxicity

基金項目：貴州省特色農產品輻照保鮮與加工工程技術研究中心（項目編號：黔科合人才平臺字[2016]5203號）;貴州省特色農產品輻照保鮮技術服務企業行動計劃（項目編號：黔科合人才平臺字[2016]5712號）。

作者簡介：唐洪濤（1986—），男，工程師，研究方向：食品營養與加工、食品檢測、食育教育等。

通信作者：李詠富（1985—），男，博士，副研究員，研究方向：農產品加工。