絨山羊毛囊發育中非編碼RNA的研究進展

王 東，梁加越，王笑冰，馮 娟，張 茹，夏慧巖，肖紅梅

(1.內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特 010010；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010010；4.內蒙古自治區生物制造重點實驗室，呼和浩特 010010)

絨山羊是中國重要的絨肉兼用型山羊品種，生產的羊絨以其特有的優良品質享譽國內外，被稱為“纖維鉆石”，在國民經濟中占有舉足輕重的地位。毛囊是皮膚的衍生物，是形成毛被的重要器官。絨山羊的毛囊結構根據形成的時間先后及不同的功能特點分為初級毛囊和次級毛囊。初級毛囊由上皮細胞和真皮層細胞分化、發育而來，生長有髓的粗毛；次級毛囊由初級毛囊發育形成，生長無髓的羊絨。它們的成熟結構由結締組織鞘、內根鞘、外根鞘、毛球和毛干等構成。初級毛囊的周期性變化不明顯，而次級毛囊具有明顯的周期變化，歷經生長期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)[1-2]。在生長期，核因子κB(NFκB)和Wnt/β-cantenin信號通路首先被激活，上皮細胞數目增加，運動能力增強[3]，形成基板；同時絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中的成纖維細胞生長因子10(fibroblast growth factors 10，FGF10)[4]、和FGF20[5]以及骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路中的骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)、BMP7[6]等信號分子被釋放使成纖維細胞運動和遷移能力增強并定向聚集，加快真皮聚集內陷形成毛乳頭細胞[7]。隨著毛乳頭細胞的形成，Wnt信號通路激活了基板上層一側,SHH(Sonic Hedgehog)信號通路，誘導毛母質細胞快速增殖分化并在其他信號通路的參與下，向真皮層延伸形成毛干和內根鞘、外根鞘，毛囊形態和結構逐漸形成。因此，高表達的Wnt信號通路和SHH信號通路成為了毛囊生長期的重要標志物[8]。毛囊的形態結構是一種動態平衡，當生長期維持一段時期后，在表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、TGF-β等信號通路的作用下[9]，Wnt信號通路激活被阻斷，并誘導促凋亡蛋白BAX的表達，毛囊可再生部位的毛母質細胞增殖減少，外根鞘角質形成細胞凋亡[10]，毛球發生萎縮，毛干停止分化，進入退行期。當細胞活性水平低下時，毛囊便進入休止期。在休止期[11]，毛乳頭細胞處于休止狀態，毛囊完全失去活性[12]。在休止期結束時，Notch、Wnt等信號通路作用使毛球開始再生，毛囊干細胞分化并增殖，并且毛囊再生部分重建，毛母質細胞新一輪增生，進入下一個生長周期。此時，由于產生新毛干，將杵狀毛干從皮膚表面推出，直至脫落[13]。毛囊的周期性變化表明間充質細胞是毛囊發生的誘導者，上皮細胞是應答者，二者間通過信號的傳導刺激了毛囊的周期性變化[14]。

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是指不編碼蛋白質的RNA，既包括已知功能的核糖體RNA(rRNA)、轉運RNA(tRNA)、環狀RNA(circular RNA，circRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和小RNA(microRNA，miRNA)，還包括一些未知功能的RNA。近年來，隨著高通量測序技術的不斷發展與完善，以及新的分子檢驗和分析方法的創新，發現了諸多除基因和蛋白水平外對絨山羊毛囊發育起調控作用的ncRNA。這些ncRNA的發現，為絨山羊毛囊發育及絨毛生長調控機理的研究提供了新的機遇。文章就miRNA、lncRNA及circRNA的發現和形成過程以及其在絨山羊毛囊發育中的時空表達及靶向調控機制的研究進行總結，為進一步挖掘調控毛囊發育的節點ncRNA和信號通路，揭示絨山羊絨毛品質調控機理提供參考。

1 絨山羊毛囊發育中miRNA的研究進展

1.1 miRNA的發現及形成

miRNA是Lee等[15]在1993年于秀麗隱桿線蟲內發現的一類長18～25 nt的ncRNA，廣泛存在于各種生物中，調節生物體生長、發育和凋亡等過程[16]，被miRNA調控的基因表達存在復雜的組合模式，具有時空特異性[17-20]，所以對miRNA功能的研究主要是通過轉錄表達及測序方式進行。它通過5′-端的6～8個種子序列堿基與其靶向基因3′-非翻譯區堿基結合成互補序列，引起靶向mRNA降解或抑制翻譯調節基因表達，從而調控絨山羊毛囊發育及絨毛生長，屬于轉錄后的調控因子(圖1)[21]。

圖1 miRNA形成的經典途徑[21]Fig.1 The classical pathway of miRNA biogenesis[21]

1.2 miRNA在絨山羊毛囊發育中的時空表達及靶向調控機制

隨著高通量測序技術和芯片等技術的不斷發展，有關調控絨山羊毛囊發育的miRNA逐漸被發現和報道。 有研究指出，利用芯片技術得到了miR-24、miR-199a、miR-200b等15個可能在毛囊生長發育中起上調作用或直接靶向Wnt信號阻斷通路的miRNAs[22]；利用高通量測序鑒定了可能在毛囊發育和絨毛的生長中起重要調控作用的316個miRNAs，并發現miR-368、miR-668等22個新miRNAs[23]。有研究報道，Solexa測序比較山羊和綿羊皮膚miRNA轉錄組，鑒定了1 910個已知miRNAs和2 261個新的成熟miRNAs，并在此基礎上鑒定出在兩個文庫中的差異表達的107個新的成熟miRNAs和1 246個已知miRNAs[24]，此結果為探究與絨山羊毛囊發育相關的miRNA及進一步闡明miRNA在絨山羊毛囊發育中的調控作用奠定了基礎；采用多組學方法鑒定了毛囊生長期與退行期表達的307個新的成熟miRNAs和差異表達的72個miRNAs，豐富了絨山羊的miRNA庫，有助于更好地了解參與調控絨山羊毛囊生長和發育的miRNA的分子機制[25]。另外，通過研究褪黑素對絨山羊毛囊發育的影響發現，在毛囊興盛前期，miRNA的下調能夠提高毛囊細胞活性，抑制毛囊細胞凋亡，推測miRNA可與褪黑素相互作用，調控毛囊生長周期，從而影響絨山羊絨毛生長[26]。所以，miRNA不僅在毛囊中表達，而且具有選擇表達性的特點[27]，并與其他因子相互作用構成調控網絡，調控毛囊生長發育相關靶基因的表達。

在皮膚毛囊生長發育過程中，miRNA及其靶向調控基因形成了多樣化的調控網絡，使得不同miRNA或同一miRNA具有多樣化的靶基因。miRNA通過所在的信號通路負調控靶向基因從而抑制或促進毛囊的生長和發育。在Wnt/β-cantenin信號通路中，miR-214靶向抑制Wnt信號通路的傳導，從而影響角質形成細胞增殖導致毛發形成減少[28]。有證據指出，miR-31的靶標為角蛋白16(KRT16)、KRT17、同源轉錄因子DLX3和FGF10，其過表達和缺失影響著BMP和Wnt/β-cantenin信號通路的活躍程度[29]。miR-let-7a的靶標為胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、C-myc和FGF5，通過調節它們所對應的信號通路影響毛囊的生長發育[30]。miR-195-5p在mRNA水平上抑制低密度脂蛋白相關受體蛋白(LRP6)的表達，調控毛乳頭細胞Wnt/β-catenin通路的活化[31]。此外，基于毛乳頭細胞構建的miR-125b的過表達模型和抑制表達模型證實了miR-125b影響FGF5、IGF-1、SHH、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、肌節同源框基因家族基因MSX2、淋巴細胞增強結合因子-1(LEF-1)、FGF7、頭蛋白NOGGIN、BMP2、BMP4、TGF-β1和β-catenin的表達，雙熒光素酶實驗驗證了miR-125b[32]與調控毛的長度的FGF5[33]和影響絨毛生長速度的TNF-α[34]之間有著直接的作用。TGF-β信號通路具有調控細胞的生長、分化、凋亡、遷移及細胞外基質的形成等多種重要的功能。有研究根據miR-1298-5p與TGF-βR1基因在毛囊周期中的表達趨勢，推測miR-1298-5p可能通過負向調控TGF-βR1基因在毛囊不同時期的表達，來調控絨山羊絨毛的生長[35]。可見，miRNA在絨山羊毛囊發育中通過抑制與毛囊再生相關基因及相關信號通路的關鍵分子調控毛囊周期以及毛囊的再生能力。在毛囊發育的不同階段，miRNA的表達水平也存在明顯差異，miRNA表達的時空特異性更加彰顯了其在毛囊生長發育中占據的重要地位。

2 絨山羊毛囊發育中lncRNA的研究進展

2.1 lncRNA的發現及形成

lncRNA是一類長度>200 nt的ncRNA分子，最初被看作是基因組轉錄的“噪音”，不具有任何生物學功能[36]。然而，1984年，Pachnis等[37]在小鼠中發現第一個真核lncRNA-H19，并在胚胎發育過程中高表達，開啟了lncRNA參與生命活動過程并發揮重要作用的一系列研究，不同物種大量的lncRNA被發現，而且證實其具有mRNA樣結構，經過剪接，具有polyA尾巴與啟動子結構[38-39]，參與細胞增殖與分化[40]、表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控等[41-43]。大多數lncRNA在組織分化發育中具有特異性的時空表達[44-45]。lncRNA有4種產生模式(圖2)[46]：①蛋白質編碼基因突變導致框架結構斷裂，從而產生lncRNA(圖2A)；②同一序列復制2次，使相鄰的ncRNA產生重復序列(圖2B)；③轉座原件序列插入之后，可產生具有功能的lncRNA(圖2C)；④非編碼基因通過逆轉錄復制，也會產生lncRNA(圖2D)。

圖2 形成lncRNA的主要模式[46]Fig.2 The origins of lncRNAs[46]

2.2 lncRNA在絨山羊毛囊發育中的時空表達及靶向調控機制

通過不同的研究方法對lncRNA進行篩選及功能驗證，揭示了lncRNA多樣化的作用機制。截至目前，發現影響毛囊發育的lncRNA有很多，但大部分lncRNA的作用主要是通過調控毛囊相關的信號通路以及相關基因的甲基化等來實現的。如應用lncRNA微陣列技術研究發現，Wnt通路中一些差異表達的lncRNA可能通過表觀遺傳修飾來調節Wnt通路抑制因子-1(WIF-1)和BMP，從而抑制毛乳頭細胞中的Wnt信號傳導，降低毛乳頭細胞誘導毛囊重建的能力。其中，lncRNA-000133、lncRNA-H19、lncRNA-HOTAIR在絨山羊毛囊發育生長期的表達水平顯著高于休止期[38]。通過對其靶基因的啟動子甲基化分析表明，lncRNA-H19、lncRNA-HOTAIR、lncRNA-000133這3個靶基因的啟動子區在休止期高度甲基化可促使其在絨山羊次級毛囊中的表達受到抑制。對羊絨周期性生長特異性lncRNA的篩選研究發現，生長期和休止期有6 127個lncRNAs表達，其中54個表達存在顯著差異，有32個上調，22個下調。對差異表達的lnc5479進行靶向敲除發現其與毛囊的生長期密切相關，并且參與角蛋白的形成[47]，該結果為進一步探究lncRNA的功能和特異的lncRNA在調控絨山毛囊發育及絨毛生長中的作用提供了理論依據。有研究報道，應用轉錄組測序技術研究發現，在次級毛囊休止期和生長期有13個差異表達的lncRNAs，其中lncRNA-599618、lncRNA-599556等6個lncRNAs均在毛囊生長期的Wnt信號通路中高表達，lncRNA-599528等4個lncRNAs在休止期高表達，這表明生長期高表達的6種lncRNAs可能與Wnt信號通路協同作用，促進毛囊基板形成及次級毛囊細胞(HFSC)的激活、分化和增殖，從而促進絨毛纖維生長，而休止期高表達的lncRNA可能抑制HFSC的分化，從而使毛囊處于休眠狀態[48]，該結果為進一步揭示lncRNA在其他哺乳動物皮膚毛囊中的周期轉換機制提供了借鑒。隨著多組學研究的發展，有研究采用多組學方法系統地鑒定了絨山羊毛囊生長期與退行期中表達的1 122個已知的lncRNAs和403個新的lncRNAs，通過差異分析尋找到173個差異表達的lncRNAs。聯合miRNA研究，建立lncRNA-miRNA-mRNA網絡，結果發現，在毛囊退行期lnc108635596通過miR-873介導靶基因TGF-β1和腦源性神經營養因子(BDNF)的表達[25]，說明lncRNA和miRNA在絨山羊絨毛生長過程中共同作用，并作為miRNA的海綿調節與毛囊的發生發育及凋亡相關的基因表達。從競爭性內源RNA(ceRNA)調控網絡角度研究，篩選出絨山羊生長期次級毛囊中4個顯著上調的lncRNAs，9個顯著下調的lncRNAs[49]，所構建的網絡表明，在山羊絨毛生長過程中，lncRNA475074可能通過與miR-653-3p競爭調控端粒聚合酶3(TANK3)的表達。因此，ceRNA調控網絡的建立為進一步研究絨山羊次級毛囊中lncRNA的功能提供了條件。還有研究指出，lncRNA與褪黑激素有密切關系，褪黑激素通過上調lncRNAMTC的表達來激活NF-κB信號通路，并對lncRNAMTC對應的靶基因的表達量檢測發現，lncRNAMTC的靶基因腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(TNFAIP3)表達明顯下調[50]，而TNFAIP3(A20)基因的下調有利于激活NF-κB信號通路[51]。也有證據證明，lncRNA5322通過調控miR-21介導PI3K-Akt信號通路，上調絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的表達促進毛囊干細胞的增殖和表皮分化[52]。由此可見，lncRNA不僅在絨山羊毛囊細胞的增殖、凋亡和分化及絨毛生長中發揮重要的調控作用，而且在其他物種如細毛羊、小鼠等哺乳動物的毛囊發育中也起到同樣的作用[41]，通過參與調控毛囊生長相關靶基因的表達與多種信號通路NF-κB、Wnt、PI3K-Akt等互作發揮生物學功能。但目前對于lncRNA調控絨山羊毛囊發育及絨毛生長相關的研究主要集中在相關lncRNA的篩選、鑒定等方面，其調控機制仍不明確。隨著分子生物學技術和基因編輯技術的快速發展，深入揭示lncRNA調控絨山羊毛囊發育及絨毛生長分子機制成為必然，從而為絨山羊絨毛品質的提高提供新的研究方向。

3 絨山羊毛囊發育中circRNA的研究進展

3.1 circRNA的發現及形成

circRNA是Diener[53]于1971年在植物類病毒中首次發現，具有閉合環狀結構的一類新型的內源性ncRNA[54]，由單個mRNA前體通過外顯子和內含子的5′-端與3′-端反向剪接而成，存在于高等真核生物細胞內[55]，富含在miRNA結合位點，在細胞中起到miRNA海綿的作用，即通過內源性競爭機制，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平。circRNA表達比其他ncRNA穩定，有組織特異性和物種保守性的特點[56]，不易被RNA外切酶降解，但可通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的介導降解[57]。circRNA按來源可分為外顯子circRNA(exon circRNA)、內含子circRNA(intron circRNA)、外顯子與內含子結合的circRNA(exon-intron circRNA)以及基因間circRNA(interegenic circRNA)[58]。但大多數為外顯子circRNA[59]。circRNA的功能多樣，除了作為miRNA海綿調控靶基因表達外[60]，還可與RNA結合蛋白(RBP)形成RNA-蛋白復合物，調控基因的轉錄，甚至少數的circRNA可以編碼、翻譯為蛋白質[61-62]。circRNA的產生有2種模型，包括套索驅動的環化模型和內含子配對驅動的環化模型(圖3)。由于RNA發生部分折疊RNA前體在轉錄過程中拉近相鄰的外顯子，使得下游外顯子的剪接供體(splice donor，SD)的3′-端和上游外顯子的剪接受體(splice acceptor，SA)的5′-端結合，致使外顯子跳躍(exon skipping)，產生包含外顯子的內部拼接套索，去除內含子序列形成具有2個外顯子的circRNA。RNA前體上2個不相鄰的內含子互補配對，使得與該內含子相連的2個外顯子相互接近，下游外顯子的剪接供體3′-端和上游外顯子的剪接受體5′-端結合，反向剪接形成套索，再切除內含子，形成circRNA[57](圖3)。

圖3 索尾插接(Backsplicing)形成模型和circRNA形成機制[57]Fig.3 Backsplicing formation model and circRNA formation mechanism[57]

3.2 circRNA在絨山羊毛囊發育中時空表達及靶向調控機制

circRNA可以作為miRNA的海綿，其與mRNA競爭miRNA的靶標結合位點，circRNA在絨山羊毛囊發育中的作用機制逐漸成為研究熱點。在絨山羊次級毛囊的毛干中鑒定出circRNA-1926，經過分析驗證，揭示circRNA-1926可通過miR-148a/b-3p的介導，調控細胞周期蛋白依賴性激酶19(CDK19)基因的表達，促進絨山羊毛囊干細胞向次級毛囊分化[63-64]，表明circRNA可通過miRNA的介導調控關鍵基因的表達來調控毛囊發育。為探究不同物種特異表達的circRNA，通過比較分析遼寧絨山羊和內蒙古絨山羊中的轉錄組序列，鑒定出絨山羊皮膚中存在13 320個circRNAs，其中差異表達的有32個。 經實時熒光定量PCR驗證得到4個circRNAs，即circRNA128、circRNA3620、circRNA4154和circRNA6854[65]。通過高通量測序獲得45、55、65和75 d絨山羊胚胎毛囊中circRNA的表達譜，鑒定出21 784個circRNAs，通過GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析表明，與毛囊發育相關的信號通路為Notch信號通路和NF-κB信號通路，將75和45 d的circRNA與miRNA和mRNA數據庫結合，構建了circRNA-miRNA-mRNA的調控網絡，預測出102對相互作用的circRNA-miRNA和126對miRNA-mRNA；通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證了其中的circRNA3236和chi-miR-27b-3p、circRNA3236和chi-miR-16b-3p具有靶向關系[66]，表明circRNA和特定的miRNA具有靶向關系，circRNA可通過miRNA調控靶基因表達。另外，在對湖羊的circFTO和circCSPP1與miR-148a和miR-10a的靶向關系研究中也得到了驗證，即此2個circRNAs可通過結合miRNA正向調節靶基因BMP7的表達而促進毛乳頭細胞的增殖，從而影響毛囊的生長發育[67]。由此可見，不管是絨山羊胎兒皮膚毛囊中circRNA的表達譜的建立還是circRNA-miRNA-mRNA調控網絡的構建，均為今后有關circRNA調控絨山羊毛囊發育機制的研究提供了方法和思路。這些研究結果對于后續進行絨山羊皮膚毛囊發育中circRNA的作用及其所在信號通路研究奠定了基礎。但由于circRNA-miRNA-mRNA形成的ceRNA網絡在毛囊生長發育中的研究還處于起始階段其調控機制十分復雜，因此circRNA在絨山羊毛囊生長發育中的相關信號通路及靶基因功能還需進一步深入研究。

4 小 結

ncRNA的發現及其功能的探究，為基因組無法詮釋的復雜性的生物發育機制提供了新的思路。由于目前對ncRNA在絨山羊毛囊發育方面的研究甚少，缺乏相應功能的數據庫，且研究大部分集中于篩選和鑒定及一些調控通路的網絡的建立，技術比較單一，而且絕大部分如miRNA、lncRNA、circRNA的功能及其重要的調控機制仍不夠清晰。因此，在以后的ncRNA研究中，利用毛囊單細胞測序、芯片等技術及實時熒光定量PCR、免疫組化、RNA干擾、過表達、原位雜交進行亞細胞定位、CRISPR/Cas9、酶聯免疫等實驗技術驗證，結合全基因組序列及蛋白組學研究發現更多有關絨山羊毛囊發育的ncRNA，建立毛囊發育3個發育階段的ncRNA數據庫和ceRNA調控網絡，深度挖掘調控毛囊發育的節點ncRNA和信號通路，同時通過表型遺傳探究主要的信號通路(如Wnt/β-cantenin)與其他通路的關聯性及受體與配體的相互作用，對揭示毛囊生長發育調控機制起重要作用。相信隨著研究的深入及生物技術的日益發展，一些與絨山羊毛囊發育相關的未知ncRNA將逐漸被發現，其功能也會被深度解析。