P[1]型A群牛輪狀病毒VP8重組蛋白的表達與免疫原性研究

姜曉明，湯 承，岳 華

(西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041)

A群牛輪狀病毒(Bovine rotavirus A，BRVA)是導致新生犢牛腹瀉的重要病原[1-2]。病牛主要表現為精神沉郁、食欲減退及水樣腹瀉等癥狀，新生犢牛感染BRVA后發病率為60%～80%，死亡率高達30%[3]。BRVA呈世界范圍內流行，給養牛業帶來巨大的經濟損失[4]。目前尚未研制出治療BRVA感染的特效藥物，疫苗是防控傳染病最經濟有效的手段，目前僅有美國研制的G6型單價BRVA減毒活苗用于臨床[5]，也有牛輪狀病毒(BRV) DNA疫苗、病毒樣顆粒疫苗、植物可食用疫苗[6-8]的研究報告，中國尚無商用BRVA疫苗。

VP4蛋白是BRVA的外衣殼刺突蛋白，能誘導機體產生中和抗體，是BRVA的重要保護性抗原之一[9]，但VP4蛋白較大，完整表達存在困難且溶解性差[10]。 VP4蛋白在胰蛋白酶的作用下裂解為VP8和VP5亞基[11]，VP8亞基上有4個中和表位[12-13]和5個線性B細胞表位，攜帶VP4的主要抗原表位，與VP4蛋白一樣能刺激機體產生中和抗體且免疫應答強度相當[14-16]，可見VP8亞基是制備BRVA亞單位疫苗的潛在靶點。本研究利用原核表達系統表達P[1]型BRVA VP8蛋白，并免疫兔評價其免疫原性，以期為研發BRVA亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、血清及試驗動物

大腸桿菌TOP10和BL21(DE3)感受態細胞、pET-30a(+)載體均購自天根生化科技(北京)有限公司；兔抗G6P[1]型BRVA血清、G6P[1]型BRVA病毒液(TCID50：105.76)、G8P[1]型BRVA病毒液(TCID50∶105.39)均由西南民族大學動物醫學實驗室制備保存。1.8～2.2 kg成年雄性新西蘭大白兔購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG購自Abbkine公司；TMB、Ultra- Signal超敏ECL化學發光底物均購自四正柏(北京)生物科技有限公司；HisCap 6FF鎳離子純化柱購自常州天地人和生物科技有限公司；Imidazole購自BioFroxx公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Boster(武漢)公司；DL5000 DNA Marker和PageRuler預染蛋白Marker均購自Thermo Fisher Scientific公司；IPTG購自Sigma公司。

電泳儀和凝膠成像系統均購自天能(上海)科技有限公司；MONTANIDE ISA 201 VG 購自賽比科(上海)特殊化學品有限公司；凝膠半干轉印裝置Trars-Blot SD和多功能免染蛋白印跡系統均購自Bio-Rad公司。

1.3 P[1]型BRVA VP8基因表達載體構建

參照國內流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1](GenBank登錄號：MN937517)VP8基因序列進行優化，在不改變任何氨基酸情況下，使其密碼子偏好性接近大腸桿菌。在其5′-端增加酶切位點NdeⅠ，3′-端增加酶切位點XhoⅠ，N-端添加His標簽，將序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，將合成的序列與經過NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET-30a(+)載體連接，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，挑取單克隆菌落，經PCR鑒定正確的陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 P[1]型BRVA VP8重組蛋白的誘導表達

參考王珍賢等[17]方法將重組質粒pET30a-VP8轉化大腸桿菌BL21(DE3) 感受態細胞，涂布于含有30 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃培養過夜，挑取單克隆菌落，震蕩培養10 h后，挑取轉化后單菌落于含30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min培養，當D450 nm值達到0.6時，將菌液分2組，分別添加0.5 mmol/L IPTG誘導表達，一組20 ℃誘導過夜，另一組37 ℃誘導6 h。誘導后離心收集菌體，以PBS 1∶100(W/V)重懸，超聲破碎15 min后離心收集上清與沉淀，進行SDS-PAGE，使用多功能免染蛋白印跡系統拍照，采用Image J軟件分析灰度值。

1.5 P[1]型BRVA VP8重組蛋白的純化

誘導后菌體使用溶解液(50 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl、0.2 mmol/L PMSF)溶解，超聲破碎15 min后離心收集上清，按照鎳瓊脂糖親和層析蛋白純化方法以5 mL HisCap 6FF鎳離子純化柱進行純化，收集到的組份經SDA-PAGE檢測。將純度高的重組蛋白組份使用透析液(50 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl)透析，每隔6 h換一次透析液，共透析4次。透析后的蛋白使用PEG20000包埋濃縮至原蛋白體積的1/2，0.45 μm濾膜過濾，分裝至1.5 mL管中，每管1 mL，于-80 ℃凍存。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定P[1]型BRVA VP8重組蛋白濃度。

1.6 P[1]型BRVA VP8重組蛋白Western blotting鑒定

參考王珍賢等[17]方法對P[1]型BRVA VP8重組蛋白進行SDS-PAGE，然后將P[1]型BRVA VP8重組蛋白轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶ 1 000 稀釋的兔抗G6P[1]型BRVA陽性血清，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，加入1∶ 5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，加ECL顯色，多功能免染蛋白印跡系統拍照。 鑒定P[1]型BRVA VP8重組蛋白反應原性。

1.7 動物分組與免疫

4只成年健康兔分為2組，每組2只。將P[1]型BRVA VP8重組蛋白稀釋為1 mg/mL，與201佐劑按1∶1(V/V)比例混合，試驗組每只兔頸背部皮下注射0.5 mg重組蛋白，首免第2周加強免疫1次，共免疫2次；對照組注射等體積的PBS。首免前0周和第1次免疫免后第1～5周對試驗兔耳緣靜脈采血并分離血清，用于抗體測定。

1.8 間接ELISA方法檢測兔血清抗體的消長

使用1 μg/mL P[1]型BRVA VP8重組蛋白包被96孔酶標板100 μL/孔，4 ℃包被過夜，用4% PEG6000于37 ℃封閉1 h，加入1∶64 000稀釋的待檢血清，同時設立陰性孔(未免疫兔血清)與空白對照孔(1% BSA)，37 ℃孵育1 h。加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶20 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。TMB 37 ℃顯色15 min，2 mol/L濃硫酸終止反應，酶標儀測定D450 nm值。以≥Cut Off值(陰性孔D450 nm值×2.1)為陽性，反之為陰性。計算免疫前后各階段每組兔血清抗體D450 nm平均值。

1.9 兔血清中和效價的測定

利用ELISA方法檢測抗體水平最高的兔血清，56 ℃水浴30 min后進行病毒血清中和試驗，分別測定兔血清對G6P[1]與G8P[1]毒株的中和效價。用DMEM營養液將待檢血清分別稀釋100和10倍，再用DMEM營養液在96孔板中倍比稀釋(21、22、23、……、210)，每個稀釋度設立4個對照孔，同時設立陽性對照孔(100 μL病毒液加100 μL維持液)與陰性對照孔(200 μL維持液)。其余試驗步驟按照病毒中和試驗固定病毒稀釋血清法進行，每天觀察細胞病變(CPE)孔數至第4天，計算兔血清中和效價。 Reed-Muench氏血清中和效價計算公式如下：

距離比例=(50%-低于50%的病變率)/(高于50%的病變率-低于50%的病變率)

中和效價的反對數=低于50%的病變率的血清稀釋度的對數+距離比例×稀釋系數的對數

2 結 果

2.1 P[1]型BRVA VP8基因表達系統的構建與鑒定

重組質粒雙酶切鑒定結果顯示，在約500與5 000 bp 出現2個條帶(圖1)，大小與預期一致，測序結果顯示目的基因序列正確插入pET-30a(+)。

2.2 P[1]型BRVA VP8重組蛋白表達情況

重組菌經IPTG誘導表達的產物經SDS-PAGE檢測，在約20 ku處有特異性條帶，重組蛋白為可溶性表達，且重組菌在37 ℃誘導6 h比20 ℃誘導過夜表達量更高(圖2)，經Image J軟件分析37 ℃誘導6 h條件下目的蛋白占總蛋白的62.08%(表1)。

圖1 重組表達質粒pET30a-VP8雙酶切電泳圖Fig.1 Double enzyme digestion electrophoresis of recombinant expression plasmid

M，蛋白質分子質量標準；1，IPTG誘導前總蛋白；2，20 ℃上清；3，20 ℃沉淀；4，37 ℃上清；5，37 ℃沉淀M，Protein Marker；1，Total protein before IPTG induction；2，Supernatant at 20 ℃;3，Precipitation at 20 ℃；4,Supernatant at 37 ℃；5，Precipitation at 37 ℃圖2 重組蛋白表達分析Fig.2 Expression analysis of recombinant protein

表1 不同溫度蛋白表達情況

2.3 P[1]型BRVA VP8重組蛋白的純化與濃度

純化的P[1]型BRVA VP8重組蛋白經SDS-PAGE顯示呈單一電泳條帶，大小為20 ku，蛋白純度>99%(圖3)。BCA試劑盒測定蛋白濃度為2.74 mg/mL，每升菌液可得到10.96 mg純化重組蛋白。

圖3 純化的P[1]型BRVA VP8重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified P[1] BRVA VP8 recombinant protein

2.4 P[1]型BRV VP8重組蛋白反應原性檢測

Western blotting 結果顯示，重組蛋白能與兔抗G6P[1]型BRVA血清抗體結合，在約20 ku處可見特異反應條帶(圖4)，證實P[1]型BRVA VP8重組蛋白具有反應原性。

圖4 P[1]型BRVA VP8重組蛋白 Western blotting 檢測Fig.4 Western blotting detection of P[1] BRVA VP8 recombinant protein

2.5 兔血清抗體的消長情況

免疫后不同時間試驗兔血清抗體水平檢測結果顯示，首免1周后抗體開始出現并迅速上升，于第3周達到高峰，至第5周仍維持在較高水平(圖5)。

2.6 P[1]型BRVA VP8重組蛋白誘導兔產生中和抗體

P[1]型BRVA VP8重組蛋白免疫兔血清對同源和異源BRVA的中和試驗結果見表2、3。采用Reed-Muench氏法計算免疫兔血清對G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效價分別為1∶17 783和1∶64。說明P[1]型BRVA VP8重組蛋白對同源毒株具有良好的中和活性，對異源毒株具有部分交叉中和活性。

圖5 免疫兔血清抗體消長曲線Fig.5 Fluctuation curve of serum antibody in immunized rabbits

表2 血清對G6P[1]型BRVA毒株中和試驗結果

表3 血清對G8P[1]型BRVA毒株中和試驗結果

3 討 論

BRVA呈世界范圍內流行，該病原導致的高發病率對養牛業造成嚴重的經濟損失，目前尚無特效藥物可用于治療BRVA引起的疾病，疫苗是預防和控制BRVA最有效的策略。VP4蛋白為BRVA結構蛋白，決定病毒的P型，且可誘導中和抗體的產生[18]。但BRVAVP4基因較長(全長2 359 bp)，完整表達存在困難[19]。VP4在胰蛋白酶作用下可裂解成VP8與VP5亞基，Dunn等[15]通過真核表達輪狀病毒(RV) VP4、VP8、VP5蛋白，并將其作為免疫原分別免疫小鼠產生的抗體中和效價分別為1∶640至1∶10 240、1∶1 640至1∶10 240、1∶640至1∶2 560，證實VP8重組蛋白與VP4蛋白一樣能刺激機體產生中和抗體，且免疫效果相當，具有研發亞單位疫苗的潛力。流行病學調查顯示,中國牛群中存在多種基因型BRVA，G6P[1]型是優勢流行株[20-21]，因此本研究合成了G6P[1]型BRVA毒株VP8基因序列，利用原核表達系統表達P[1]型BRVA VP8重組蛋白。

原核表達系統操作簡單、時間短、成本低，且表達量高，是表達外源蛋白的首選方案。但原核表達的蛋白沒有經過修飾，不一定具有活性，而BRVA VP4蛋白抗原表位大多為線性，不需要翻譯后修飾[22]，且Nasiri等[23]、Kim等[24]均證實BRVA VP8原核重組蛋白免疫雞后可產生抗體。本研究結果顯示，VP8重組蛋白可誘導機體產生高水平中和抗體，證實原核表達不影響BRVA VP8蛋白的免疫原性。原核表達系統表達的蛋白主要以包涵體與可溶性2種形式存在，包涵體表達需要復性，復性過程復雜，復性過程中變性劑與去垢劑的使用可能會引起蛋白質的改變，在一定程度影響蛋白的免疫原性[25]。本研究采用可溶性表達策略獲得大量P[1]型 BRVA VP8可溶性蛋白，無需復性且易于純化，為BRVA VP8重組蛋白的生產策略提供了參考。

目前商品化BRVA疫苗僅有美國USDA批準的G6型單價減毒疫苗[26]，也有BRVA滅活疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗、轉基因植物疫苗等的研究報告，常繼濤等[5]制備的BRVA 基因重配二價減毒疫苗免疫牛后可產生高水平的中和抗體，中和抗體效價最高可達1∶20 480。張儉偉等[27]制備BRV CHLY株滅活疫苗免疫昆明小鼠可檢出高水平IgG抗體，證實其具有良好的免疫原性。Wei等[28]利用BRVA GSB01株VP7基因原核表達VP7重組蛋白，制備亞單位疫苗免疫小鼠對初生乳鼠保護率達91.7%。BRVA DNA疫苗、植物轉基因疫苗等均具有免疫原性[29-31]。亞單位疫苗免疫與其他疫苗相比不僅能誘導免疫動物產生高水平抗體，還具有安全性較高、成本低、操作簡單等優勢，具有良好的市場潛力，為進一步研發BRVA亞單位疫苗提供參考數據。

4 結 論

本研究以pET-30a(+)為載體，以大腸桿菌BL21(DE3)為表達工程菌成功高效表達了P[1]型BRVA VP8蛋白，該蛋白具有良好的免疫原性和反應原性，為進一步研發BRVA亞單位疫苗提供參考。