牛丙型肝炎病毒研究進展

郭鑾英，李家磊，金芹芹，馬 駿，劉 全

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528000；2.中國農業科學院生物技術研究所,北京 100081)

丙型肝炎病毒(Hepacivirus)是一類有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)成員。2020年，國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Virus,ICTV)將丙型肝炎病毒分為14個不同病毒種。目前為止，除了田鼠可被丙型肝炎病毒F和J型感染外，其他病毒種均存在宿主特異性。A型丙型肝炎病毒感染馬[1]，B、C型感染猴和人[2]，D型感染猴[3]，E、F、G、H、I和J型感染嚙齒動物[4]，K、L和M型感染蝙蝠[5]，N型感染牛[6]。

長期以來，丙型肝炎病毒屬只有人丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)1個種。HCV在自然情況下，只感染人和黑猩猩，是導致人類慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病原體之一[7]。全球約有5 800萬人感染慢性HCV，每年約有150萬名新感染者，2019年約有29萬人死于丙型肝炎[8]，目前尚無針對HCV的有效疫苗，由于缺乏合適的動物模型，HCV的致病機理及疫苗的研制受到極大的阻礙，積極治療及控制病毒感染成了主要防控手段。

近年來隨著高通量測序技術的廣泛應用，研究者在不同動物物種中發現了丙型肝炎病毒，包括馬[9-10]、嚙齒動物[11]、蝙蝠[5]和多種非靈長類動物[2]。目前該病毒屬已增加至14個病毒種(A～N種)，其中最新的病毒種是——N型丙型肝炎病毒(Hepacivirus N，HNV),2015年，德國首次報道在奶牛血清中發現該病毒，因此也稱牛丙型肝炎病毒(Bovine hepacivirus,BovHepV)，HNV同HCV相似，能造成宿主無明顯臨床癥狀的急性和慢性感染[12]，因此盡管沒有肝損傷跡象，但HNV的感染對畜牧業的發展及與病毒密切接觸的農民和育種人員健康均構成潛在威脅。目前HNV的研究及報道內容有限，國內更是缺乏對HNV研究進展的系統整理，筆者就HNV的病原學研究、流行情況及檢測方法方面的研究進展進行綜述，以期為HNV的病原學發展、發病機制、人畜共患感染潛力的研究提供參考。

1 HNV特征

1.1 HNV的形態結構

HCV呈球形，直徑50 nm，有囊膜，病毒核心直徑約30 nm[13]，詳細結構尚不明確。而黃病毒科成員的病毒顆粒形態、基因組結構和復制方式相似[14]，加之丙型肝炎病毒屬病毒在體外細胞中增殖能力有限，目前尚無HNV分離成功的報道，因此可參照HCV的病毒顆粒形態，尋找HNV的病毒顆粒并觀察記錄。

1.2 HNV的基因組結構及功能

HNV的基因組結構及功能與黃病毒科病毒成員相似。 HNV為單股正鏈RNA病毒，長約8.8 kb。HNV基因組包含非編碼區5′-UTR、3′-UTR及1個長開放閱讀框(ORF)。ORF編碼1個含2 779個氨基酸的前體多蛋白，前體多蛋白在信號肽酶和蛋白酶共同作用下，被加工成約10個蛋白，其中包括3種結構蛋白：衣殼蛋白C(Core,C)、囊膜蛋白E1(為糖蛋白)、囊膜蛋白E2(含有能誘導產生中和抗體的抗原表位)。此外，還有7種非結構蛋白p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[15]。其中，5′-UTR、NS3及NS5B是HNV的高度保守區，NS3作為解旋酶和蛋白酶，還具有部分RNA聚合酶復合物的功能，NS3負責多聚蛋白酶的大部分剪切作用，而宿主蛋白酶參與剩余的剪切作用[13]。

圖1 丙型肝炎病毒基因組模式圖[14]Fig.1 Hepacivirus genome model map[14]

1.3 HNV的遺傳多樣性

2019年，Gang等[16]根據HCV的分類原則，將HNV分為1個基因型和7個亞型(A～G亞型)，2021年，Shao等[17]將HNV分為2個基因型和8個亞型(圖2)，其中HNV的A和F亞型主要存在于德國；加納流行B、C亞型；巴西流行D亞型；中國廣東、江蘇及四川鑒定發現存在E、G和H亞型[16-19]，表明HNV基因型和亞型的地理分布復雜。

整體上，HNV的基因多樣性遠不如HCV豐富，一方面，可能是因為已有的HNV研究成果是建立在地理隔離較大的牛群上，意味著可能存在更多的HNV有待發現，這與在歷史上人們發現不同HCV基因型的過程相似[20]；另一方面，可能是人類圈養動物的行為對病毒多樣性有一定的影響，如影響了HNV毒株跨地域傳播及基因重組。最后，想要更詳細地研究HNV的遺傳多樣性，需要更大的樣本量、縱向研究或動物感染試驗，對不同牛種的HNV流行情況進行調查也有助于了解病原與病原、病原與生態之間的進化關系。

值得注意的是，近幾年隨著高通量測序技術的發展，HNV基因亞型的種類不斷增加，分布情況也逐步改變。截至2021年中國至少存在HNV的4種亞型[17]，這可能是由于中國活牛國際貿易頻繁，促進了HNV的跨界傳播。此外，目前僅在中國廣東、江蘇、云南和四川等有限地區的牛中檢測到HNV[16,18-19]，擴大HNV流行病學調查范圍，可更好地揭示中國HNV的遺傳多樣性和流行病學特征。

1.4 HNV的致病機理

研究表明，持續的HCV感染與原發性肝癌、肝硬化和自身免疫性肝炎有關[21]，但非人類靈長類動物、嚙齒動物、蝙蝠、牛和馬的肝炎病毒的致病機理和特征尚不明確。

有研究發現，兩頭持續性感染HNV的牛檢測不到病毒抗體[22]。已知人或動物慢性感染病毒時，在血清中基本能檢測到病毒抗體，但當慢性感染HCV的患者共感染人類免疫缺陷綜合征病毒(HIV)時，其CD4+T細胞衰竭引起的免疫抑制會導致檢測不到HCV抗體[23-24]。據此推測這2頭牛可能是存在機體免疫抑制，另一種推測是HNV可通過垂直傳播使幼畜產生特異性免疫耐受。

HNV 5′-UTR中存在1個核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)，可與宿主因子microRNA-122(miR-122)結合，在不依賴5′-UTR帽子結構的情況下顯著增強病毒翻譯效率[25-26]。牛肝臟組織中存在大量miR-122，在HNV生命周期中起著關鍵作用[27]，未來的研究集中于miR-122是如何影響病毒復制的過程，或可闡明HNV的致病機理。

2 HNV的流行病學研究

2.1 臨床癥狀

人急性感染HCV常因無明顯臨床癥狀而被忽略，感染者不能自行清除病毒則發展為慢性感染，這是導致肝炎和肝癌的主要原因[28]。有證據表明，馬感染丙型肝炎病毒時病毒的清除速度比人更快速，因此只會引起較輕微的肝臟炎癥,且馬的品種和年齡也會影響病毒感染結果[29]。

HNV同大多丙型肝炎病毒相似，有強嗜肝性，可造成牛無明顯臨床癥狀的急性和慢性感染[29-31]，HNV慢性感染時間可達9個月甚至更久[22]。但感染HNV的牛肝臟生化指標正常，未見肝損傷或病變[32-33]，表明肝損傷與肝臟內病毒滴度之間沒有相關性。盡管這一發現出人意料，但對于肝病毒感染來說并不少見，如HCV驅動肝損傷的發病機制主要是免疫介導的[34]，此外，參考HCV從感染到致病甚至引起肝癌一般需要幾十年的時間，目前沒有HNV感染引起動物產生臨床癥狀的相關報道可能正是因為HNV的慢性感染尚未發展到臨床期其宿主就被宰殺。

2.2 流行情況

HNV在牛群中呈高度流行趨勢。自2015年Christine等[12]首次通過高通量測序技術在德國奶牛血清中發現一種新型丙型肝炎病毒HNV后，世界范圍內多個研究陸續報道了HNV的在牛群中流行率在0.2%～19.9%[6,12,20,22,33-35]。2015年，研究者在非洲牛群中檢測到HNV并對12個養殖場的牛群進行核酸篩查，結果顯示，6個牛場具有陽性病例[6]。2017年，Canal等[32]利用貝葉斯系統分析方法證明HNV可能至少在1996年就在巴西流行，比德國的報道要早20年。2019年，中國商業化的血清中檢測到HNV核酸[16]。值得一提的是，2021年，有研究者在中國廣東的蜱中發現HNV新亞型并獲得全基因組[17]，提示蜱可能是HNV潛在的傳播媒介。

2.3 易感宿主

目前認為牛科動物為HNV的主要宿主，其中以牛為主，有可能感染共同圈養的羊，病毒感染無性別及年齡差異[36]。2020年，強欣[37]首次在云南的羊體內發現HNV，羊是牛科羊亞科的統稱，與牛親緣關系較近，所以牛羊一同飼養造成HNV感染羊的可能性非常大。考慮到其他肝病毒的物種特異性，HNV可能不會感染牛科以外的物種，但動物丙型肝炎病毒的 NS3/4A 蛋白酶可切割動物宿主及人的先天免疫接頭——線粒體抗病毒信號蛋白 (mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)來規避宿主的免疫反應，導致干擾素產生減少并有助于丙型肝炎病毒的持續感染[38]，在人獸共患病暴露的情況下，人類MAVS可能無法有效抑制這些非人類病毒的復制。

2.4 傳播途徑

丙型肝炎病毒幾乎完全通過血液、血液制品和被血液污染的物體進行傳播。Gather等[39]在一項馬的研究中，揭示了動物丙型肝炎病毒存在垂直傳播的可能。

對于牛而言，受血液污染的注射器是最重要的傳播因素。初步懷疑未更換的針頭、精液為HNV潛在的感染源，具體的傳染源、傳播途徑及傳播機制還需深入研究。德國一項HNV流行病學調查顯示，陽性血清宿主(牛)的鼻咽拭子核酸檢測為陰性[12]，表明該病毒可能不是通過鼻分泌物在動物之間傳播的。中國在商品化的血清中檢測出HNV核酸[16]，揭示HNV可能垂直傳播給胎牛。2021年在中國廣東蜱中發現HNV新亞型[17]，但蜱蟲可能只是病毒的傳播載體，而不是病毒的自然宿主。

3 HNV的檢測診斷

目前，黃病毒科病毒的檢測方法已得到發展和推廣，可分為基于抗原、抗體的免疫學檢測方法和基于核酸序列的分子生物學檢測方法兩類[40]。免疫學方法包含酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、中和抗體試驗(VNT)、熒光素酶免疫沉淀反應系統(luciferase immunoprecipitation systems,LIPS)等[25]。分子學方法有直接測序、PCR、特異性探針雜交法等。

HNV的鑒定及檢測采用何種方法主要取決于實驗室的現有條件及目的。成熟的免疫學方法對試驗條件要求不高，對臨床而言，免疫學檢測方法提供了快速、簡便、高效的方法；評估病毒在動物種群中受感染的比率及感染既往史，免疫學(血清學)調查可提供比核酸檢測更真實的結果。對于流行病學研究而言，確定病毒基因型、準確定位到病毒亞型的核酸檢測方法也是必需的。每種方法都有各自的優點和不足，所有這些方法都能正確辨別病毒基因組別，但只有核苷酸測序能有效區分病毒亞型。傳統檢測方法結合多組學聯合分析可更全面、更系統、更深入地研究新發病毒的生物學特征及其感染宿主后的發病機理，能為病毒的異質性特征分析、新型靶向藥物開發和疫苗研發提供更為可靠的理論依據和數據支撐。

3.1 分子生物學診斷

Elia等[31]利用針對5′-UTR基因區的實時熒光定量RT-PCR探針法發現在配對的血清和肝臟樣本中病毒載量之間存在正相關現象[34]，表明病毒血癥水平可能反映了肝臟中的病毒量。

針對新型、未知病毒或變異較活躍的病毒，如丙型肝炎病毒，高通量組學測序技術與傳統分子生物方法相比具有顯著優勢，僅需投入少量核酸即可構建文庫得到大量數據，是科學研究中強有力的工具，HNV就是基于高通量組學測序技術發現并進行深入研究的[5,41-42]。隨著高通量組學方法的快速發展，先前報道的HNV保守引物已不適用于新發現的HNV基因亞型的檢測，需研究者不斷更新檢測方法。

3.2 免疫學診斷

ELISA是利用表達重組蛋白作為抗原，抗體與酶復合物結合，通過顯色來檢測血清中病毒的抗體水平[43]。ELISA方法操作簡便、特異性強、靈敏度高、時間短、效率高，適用于臨床檢測數量較多的血清樣品[44]，以及牛羊群HNV的流行病學調查，目前HNV的ELISA檢測研究還完全空白。

有研究者構建HNVNS3基因的LIPS檢測方法[22]，但該方法與馬丙型肝炎病毒存在交叉反應現象，在此之前也有報道馬丙型肝炎病毒NS3融合蛋白與牛血清樣本產生免疫反應[10]，因此免疫學檢測方法也存在不足之處。

4 HNV的預防控制

伴隨養殖模式多樣化、養殖密度高、從業人員素質參差不齊、對HNV沒有足夠的認識，HNV防控形勢還遠不盡如人意。截至目前，既無有效的治療方法，又無免疫預防制劑用來防控HNV。

控制HNV的主要目標是為了進一步預防畜群出現感染或持續性感染，但尚無經濟可行的控制措施。控制HNV首先需通過檢疫篩查和淘汰感染動物，畜群要避免引入感染動物，這個策略成本略高，因其需要對畜群進行血清學調查并盡量把陽性動物隔離，使用核酸探針和RT-PCR可能更敏感，但成本較高。另一種方法是只允許免疫成年動物引入畜群，但目前尚無HNV的預防制劑。

HNV的防控策略很大程度上依賴于嚴格的生物安全。HNV可能通過血液、垂直傳播及節肢動物叮咬途徑感染牛，養殖場噴灑殺蟲劑滅蚊和清除蚊及蜱等的滋生可有效減少HNV的感染；群體注射疫苗時應加強監控，杜絕注射針頭的交叉使用；此外做好環境消毒，建立經濟、快速的檢測方法，及時監測、發現并隔離病牛，加強HNV的流行病學研究是預防和控制HNV傳染的重要措施。

5 小結與展望

在過去的十年中，已在不同動物中發現了HCV同源病毒，極大促進了對HCV起源和進化的理解，并有利于在同源動物模型中研究HCV感染的發病機制和免疫應答能力。特別需要指出的是，HCV具有很強的變異能力[45]，可能導致感染率的增加或不可預測的宿主適應性，可能是導致其跨種傳播的重要因素。目前，尚不清楚HNV是否會感染人類，而全世界牛的種群規模巨大，存在多種直接和間接(即食源性)感染途徑，突出了其作為病毒宿主的作用，可能需對這些新病毒進行監測和詳細描述，以排除其對公共衛生造成的風險。

與其他病毒相比，HNV的研究進展甚微，除了其為2015年新發現的病毒以外，主要有以下原因：①HNV感染通常是無癥狀或非致命性的；②丙型肝炎病毒在細胞中的增殖能力有限，HNV的分離培養體系還沒有完善；③HNV動物模型尚未建立起來，這些因素給研究者們在HNV上開展工作帶來了極大的挑戰。因此，建立和優化HNV的分離培養體系及動物模型是需要解決的首要問題。除此之外，今后的研究方向可分為以下幾點：①建立完善且高效的診斷方法，如ELISA檢測法；②加強HNV的基因結構與功能的基礎研究；③建立系統的HNV流行病學資料；④加強對病毒溯源、變異及演化機制方面的研究，明確病毒的傳播規律及病毒變異與致病性之間的關系；⑤加強HNV與牛肝臟疾病的相關性研究，揭示HNV的入侵途徑、致病機制、逃逸機制、免疫機制等；⑥研發高效的預防和治療藥品，如疫苗等。

隨著科學技術的進步，發現和鑒定新的病原微生物的能力越來越強。從發現HCV的存在到鑒定其病毒序列經歷了14 年，到2003年科學家們發現并鑒定嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)耗費了幾個月[46]，而如今鑒定SARS-CoV-2只用了不到1個月[47-48]。未來是否還會出現新的致病性病原微生物難以預測，但目前的科學技術讓人們有信心也有能力盡早發現鑒定病原微生物，通過進一步研究來控制其感染對人類或動物健康帶來的危害。