1株黃曲霉頡頏菌的鑒定及其抑菌活性成分分析

李天溪，黨 萌，龍 淼

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，重要家畜疫病研究教育部重點實驗室，沈陽 110161)

黃曲霉(Aspergillusflavus)作為曲霉屬真菌能通過產(chǎn)生分生孢子的方式污染多種農(nóng)作物，可導(dǎo)致花生黃霉病、玉米穗腐病[1]等多種常見的植物病害。其在受到刺激(如高溫、干旱)時產(chǎn)生的黃曲霉毒素[2]是造成食品及飼料污染的主要原因[3]。人畜誤食污染的農(nóng)副產(chǎn)品會感染具有高發(fā)病率和死亡率的曲霉病，出現(xiàn)呼吸衰竭或神經(jīng)麻痹等癥狀[4-5]，給人們帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和安全隱患。但常見的物理化學(xué)等防治方法又存在藥物殘留等諸多弊端。近年來，生物防治因其專一性、環(huán)境友好性、易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)勢逐漸成為熱點[6]。生防菌的篩選鑒定為安全有效地抑制黃曲霉污染提供了可能[7]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)可頡頏多種導(dǎo)致植物患病的致病真菌[8-9]，其不僅能抑制黃曲霉的生長，對黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素也有很好的降解效果[10]，是一種很有開發(fā)前景的生防菌。基于此，本試驗嘗試從試驗室保存的若干菌株中篩選鑒定黃曲霉頡頏菌，以期為實際生產(chǎn)應(yīng)用中通過生物防治方法安全有效地抑制黃曲霉污染提供理論依據(jù)。

生防菌對真菌的頡頏作用多源自于其代謝產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)[11-12]，這些物質(zhì)主要是存在于菌株無菌發(fā)酵上清液中的酶、抗生素、細(xì)菌素或其類似物及一些次生代謝產(chǎn)物和副產(chǎn)物。通過代謝工程或優(yōu)化頡頏菌的培養(yǎng)條件可使頡頏菌高水平產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，從而產(chǎn)生更好的抑菌效果[13-15]。本研究對菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行了探索，并分離頡頏菌抗真菌活性成分，以期為進(jìn)一步研究抗菌機制和量產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

74種供試菌株由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)與科學(xué)學(xué)院臨床教研實驗室保存。

黃曲霉產(chǎn)毒菌株購自中國科學(xué)院微生物研究所(編號：3.4408)。孢子懸液的制備：黃曲霉菌通過高鹽查氏培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72～96 h充分形成孢子。刮取孢子到裝有滅菌水和數(shù)顆玻璃珠的錐形瓶中混合振蕩1.5 h，活化并分散孢子。紗布過濾后制成單孢子懸液，通過血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整濃度至107CFU/mL。

1.2 主要試劑及儀器

革蘭氏染色劑購自杭州濱和微生物試劑有限公司；核酸染色劑(GoldView)、50×TAE、考馬斯亮藍(lán)R-250、Tris、硫酸銨均購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組總DNA提取試劑盒、TaqPCR 2×Master Mix均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PBS購自武漢賽維爾生物科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司。

AB104-S型分析天平購自Mettler Toledo公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺購自蘇州安泰有限公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機購自Thermo Fisher Scientific公司；凝膠成像儀、PCR儀、電泳儀均購自Bio-Rad公司；細(xì)菌過濾器(0.22 μm)購自白鯊生物科技有限公司；顯微鏡購自Leica公司；HiTrap Capto DEAE色譜柱(5 mL)；SuperdexTM75 Increase 10/300 GL色譜柱和KTA蛋白純化系統(tǒng)均購自Cytiva公司。

1.3 培養(yǎng)基

根據(jù)文獻(xiàn)[16]配制GAM液體/瓊脂培養(yǎng)基、高鹽查氏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、LA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、SYP培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基。

1.4 方法

1.4.1 黃曲霉頡頏菌篩選 在PDA培養(yǎng)基中加入一定量配好的黃曲霉孢子懸液搖晃混勻制備固體平板，挑取供試菌單菌落用“十字劃線法”劃板，28 ℃培養(yǎng)72 h，以未接菌平板為空白對照，對黃曲霉頡頏菌進(jìn)行初篩。

初篩通過的菌株在GAM液體培養(yǎng)基增菌24 h，菌液離心并濾掉菌體后取1 mL注入PDA培養(yǎng)基中制備固體平板。在平板中間打孔并注入25 μL黃曲霉孢子懸液，28 ℃培養(yǎng)72 h，以無菌空白培養(yǎng)基代替上清液為對照，對黃曲霉頡頏菌進(jìn)行復(fù)篩。

測量黃曲霉生長直徑，用抑菌率表示頡頏菌無菌上清液的抗菌效果。每個處理重復(fù)3次，取平均值作為測定結(jié)果。抑菌率計算公式：

抑菌率(%)=(對照組直徑-試驗組直徑)/對照組直徑×100%

1.4.2 黃曲霉頡頏菌鑒定 將菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)特征并取樣進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。應(yīng)用《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》所述方法及鑒定程序?qū)赀M(jìn)行生理生化鑒定。

通過基因測序的方法對菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。應(yīng)用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取頡頏菌DNA，采用16S rDNA與gyrB基因組合的方式，通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)序列。16S rDNA上、下游引物為F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R1492：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。gyrB基因上、下游引物為UP-1SF：5′-ATTGGTGACACC-GATCAAACA-3′；UP-2SR：5′-TCATACGTAT-GGATGTTATTC-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系均為50 μL：TaqPCR Master Mix 25 μL，DNA 模板4 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存30 min。將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中使用BLAST程序分別對所得的16S rDNA和gyrB基因序列進(jìn)行比對。應(yīng)用DNAStar及Mega 7.0軟件進(jìn)行相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.4.3 頡頏菌最佳培養(yǎng)條件測定 通過單因素試驗，在不同的培養(yǎng)基(NA、LA、MRS和SYP)、培養(yǎng)基裝液量(15、30、40、50、75和100 mL)、溫度(10、20、30、37、40和50 ℃)、轉(zhuǎn)速(10、60、120、140、180和240 r/min)、培養(yǎng)時間(12、24、36、48 和60 h)、接種量(1%、2%、3%、4%和5%)及pH (5.0、6.0、7.0、8.0和9.0) 7個培養(yǎng)條件條件下培養(yǎng)頡頏菌制備菌液。按照復(fù)篩的操作及計算抑菌率的方法驗證菌液作用效果。

1.4.4 抗真菌活性粗提物對黃曲霉作用的評價 參考文獻(xiàn)[17]采用硫酸銨沉淀法對頡頏菌無菌發(fā)酵上清液進(jìn)行粗提取：菌株活化后以1%接菌量接種于 LB 培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)3 d后4 ℃、9 000 r/min離心15 min取上清液。向其中加入硫酸銨至其飽和度為50%，4 ℃過夜。之后4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用適量PBS緩沖液收集沉淀。透析過濾得到蛋白粗提液。

觀測粗提物對黃曲霉菌絲生長、重量及形態(tài)的影響。 PDA平板中央打孔注入黃曲霉孢子懸液，在距孔2 mm處放置滴加粗提物的濾紙片，用等量50%硫酸銨溶液處理的濾紙片作對照，觀察菌絲生長情況。再在其中挑取正常生長的和受抑制的菌絲分別做成切片并用棉蘭染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異。另外，分別將0、400、800和1 000 μL粗提物加入含有黃曲霉孢子混懸液的PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d后過濾菌體并烘干稱重。

1.4.5 抗真菌蛋白的分離純化及其活性評價 通過陰離子交換色譜初步純化。按上述方法制備粗提液并將其裝載到HiTrap Capto DEAE色譜柱上，用線性濃度梯度為0.01～2.0 mol/L的Tris-NaCl(pH 8.0)緩沖液以1 mL/min的流速洗脫，按照吸收峰的不同分別收集洗脫液。制備含有黃曲霉孢子的PDA固體平板并打孔，分別注入不同組分的洗脫液每孔50 μL，以滅菌水作對照，37 ℃培養(yǎng)過夜，評估各組分抗真菌活性。

之后通過凝膠過濾色譜進(jìn)一步純化抑菌效果好的組分。將待測液裝載到SuperdexTM75 Increase 10/300 GL色譜柱上，用緩沖液(含20 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl,pH 8.0)以0.2 mL/min的流速洗脫，按照吸收峰的不同分別收集洗脫液。按上述方法檢測各組分抑菌情況。

1.4.6 抗真菌蛋白氨基酸序列測定 各組抗菌蛋白通過SDS-PAGE得到蛋白條帶。結(jié)合抑菌情況進(jìn)行分析，選取相應(yīng)的條帶交由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進(jìn)行質(zhì)譜測序鑒定。通過BLAST程序與NCBI蛋白序列數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列進(jìn)行比對，初步判斷所得抗菌蛋白的種類及功能。

2 結(jié) 果

2.1 頡頏菌的篩選

初篩結(jié)果顯示，有5株菌可抑制黃曲霉生長并形成抑菌帶(圖1),復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)，僅編號為B10的菌株對黃曲霉有明顯頡頏效果(圖2)，黃曲霉直徑平均值為3.15 cm，對照組為5.21 cm，抑菌率達(dá)到39.54%。證明菌株B10抑制了黃曲霉的生長。

圖1 黃曲霉頡頏菌初篩結(jié)果Fig.1 Preliminary screening results of antagonistic strains of Aspergillus flavus

A，對照組；B，試驗組A，Control group;B，Experimental group圖2 黃曲霉頡頏菌復(fù)篩結(jié)果Fig.2 Rescreening results of antagonistic strains of Aspergillus flavus

2.2 頡頏菌的鑒定

培養(yǎng)24 h后，平板表面長出一個個微隆起的白色圓形菌落，表面粗糙有褶皺，直徑3～4 mm(圖3)。由圖4和表1可知，菌株B10是一種能產(chǎn)生孢子的、圓桿狀革蘭氏陽性好氧細(xì)菌，接近芽孢桿菌屬。

以通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條1 500 bp左右的16S rDNA序列和1條1 000 bp左右的gyrB基因序列(圖5)。通過序列比對及相似性分析發(fā)現(xiàn)，菌株B10與解淀粉芽孢桿菌GD4a(HM055603.1)的16S rDNA序列相似性為98.5%，在同一分支(圖6、7)；與解淀粉芽孢桿菌JX014631.1在同一分支且gyrB基因序列相似性為99.8%(圖8、9)。可確定此菌為解淀粉芽孢桿菌，保藏在中國微生物菌種保藏中心(保藏號CCTCCNO:M2018353)。

2.3 頡頏菌最佳培養(yǎng)條件的測定

不同培養(yǎng)條件下菌株B10對黃曲霉的抑制效果存在差異。由圖10A可知，以LA為培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株B10抑菌率最高，達(dá)到46.56%，后續(xù)試驗均以LA為培養(yǎng)基。由圖10B可知，40 ℃時得到最高抑菌率32.84%，其他溫度下抑菌率低或幾乎不抑制。由圖10C可知，培養(yǎng)36 h效果最好，抑菌率達(dá)到31.53%，其他時間對應(yīng)的抑菌率由高到低排序為60 h>48 h>24 h>12 h。由圖10D可知，在接菌量到達(dá)3%前，接種量越大抑菌效果越好，最高抑菌率達(dá)到28.15%,之后迅速下降，抑菌效果極微弱。由圖10E可知，pH為6.0和7.0時抑菌效果均較好，抑菌率分別為28.85%和26.53%。由圖10F可知，120 r/min的抑菌效果最好，抑菌率為26.46%。由圖10G可知，裝液量為30 mL時抑菌率高達(dá)29.37%。

圖3 菌株B10菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of strain B10

圖4 菌株B10革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)Fig.4 Gram staining result of strain B10 (1 000×)

表1 菌株B10生理生化鑒定結(jié)果

1,陰性對照；2，16S rDNA；3，gyrB基因；M，DL2000 DNA Marker1，Negative control；2，16S rDNA；3，gyrB gene;M，DL2000 DNA Marker圖5 16S rDNA及gyrB 基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electropherogram of 16S rDNA and gyrB gene PCR products

圖6 菌株B10的16S rDNA序列相似性分析Fig.6 Similarity analysis of 16S rDNA sequence of strain B10

圖7 菌株B10與參考株基于16S rDNA序列的的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain B10 and reference strains based on 16S rDNA sequence

圖8 菌株B10的gyrB基因序列相似性分析Fig.8 Similarity analysis of gyrB gene sequence of strain B10

圖9 菌株B10與參考株基于gyrB基因序列的的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of strain B10 and reference strains based on gyrB gene sequence

A,培養(yǎng)基；B,培養(yǎng)溫度；C,培養(yǎng)時間；D,接種量；E,初始pH；F,轉(zhuǎn)速；G,培養(yǎng)基裝液量A,Culture medium；B,Culture temperature；C,Culture time；D,Inoculation amounts；E,Initial pH；F,Rotating speed；G,Culture medium volume圖10 不同培養(yǎng)條件下菌株B10對黃曲霉的抑菌率Fig.10 Bacteriostatic rate of strain B10 against Aspergillus flavus under different culture conditions

2.4 粗提物對黃曲霉菌絲的影響

由圖11可知，粗提物的添加抑制了黃曲霉的正常生長，形成了抑菌帶，使菌株呈“方塊”型，而對照組黃曲霉生長正常,證明粗提物對黃曲霉有抑制效果。

顯微鏡下菌絲形態(tài)見圖12。由圖12可知，正常黃曲霉的菌絲較筆直，孢子為規(guī)則的圓形或橢圓形。而粗提物作用下的黃曲霉菌絲則呈不規(guī)則彎曲狀，菌絲體粗細(xì)不一。表明粗提物對黃曲霉菌絲形態(tài)造成了嚴(yán)重破壞，影響黃曲霉生長發(fā)育。

對菌絲干重的測定結(jié)果見圖13。由圖13可知，隨著粗提物含量的增加，黃曲霉菌絲重量呈明顯下降趨勢。 未經(jīng)處理的菌絲干重為3.20 g，當(dāng)粗提液加入量達(dá)1 000 μL時，菌絲的重量減少到0.13 g，同比減少了96.05%。

A，對照組；B，粗提物組A，Control group；B，Crude extract group圖11 抗真菌活性粗提物對黃曲霉菌的作用效果Fig.11 Effect of crude extract with antibacterial activity on Aspergillus flavus

A,正常菌絲形態(tài)；B，粗提物作用下的菌絲形態(tài)A,Normal mycelial morphology;B,Mycelial morphology under the action of crude extract圖12 抗菌活性粗提物對黃曲霉菌絲形態(tài)的影響(400×)Fig.12 Effect of crude extract of antibacterial activity on the morphology of Aspergillus flavus mycelia (400×)

圖13 抗菌活性粗提物對黃曲霉菌絲干重的影響Fig.13 Effect of crude extract with antibacterial activity on the dry weight of Aspergillus flavus mycelium

2.5 抗真菌蛋白的分離純化及活性評價

粗提物經(jīng)過陰離子交換色譜得到具有5個峰的洗脫曲線(圖14)。各組分抑菌結(jié)果顯示，培養(yǎng)12 h后，5個蛋白組中2、3號峰出現(xiàn)明顯抑菌圈且直徑較大，分別為1.52和1.23 cm。5號峰也出現(xiàn)抑菌圈，相較2、3號小，平均直徑為0.81 cm，但其抑菌圈內(nèi)最干凈，抑菌帶邊緣最清晰。其他組分無抑菌效果。培養(yǎng)2 d后再次觀察發(fā)現(xiàn)，除5號峰外，其余各組分抑菌圈均消失(圖15)。

凝膠過濾色譜進(jìn)一步純化組分5，得到的洗脫峰曲線見圖16。各組分抑菌結(jié)果顯示，7個蛋白組中，只有5-2和5-3出現(xiàn)清晰且明顯的抑菌圈，平均直徑分別為1.21和1.08 cm，且后續(xù)抑菌圈不消失(圖17)。其余5個組分均無顯著抑菌效果。

2.6 蛋白測序分析

通過SDS-PAGE制得組分5蛋白條帶，結(jié)合抑菌情況，選取組分5-2和5-3蛋白條帶送測序。返回數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列進(jìn)行比對，得到一系列蛋白鑒定信息。整理數(shù)據(jù)并查閱相關(guān)文獻(xiàn)之后，羅列了5-2和5-3中存在抗真菌可能性的8種蛋白(表2)。

圖14 陰離子交換結(jié)果Fig.14 Anion exchange results

圖15 組分5的抑菌效果Fig.15 Antibacterial effect of component 5

圖16 組分5純化結(jié)果Fig.16 Purification results of component 5

圖17 5-2和5-3的抑菌效果Fig.17 Antibacterial effect of 5-2 and 5-3

表2 存在抗真菌可能性的蛋白

3 討 論

生防菌的篩選鑒定一直是生物防治的重要方法之一。本試驗篩選出的解淀粉芽孢桿菌是畜禽養(yǎng)殖中常見的益生菌[18]，在防治農(nóng)作物病害上也有十分廣泛的應(yīng)用[19]。很多取得專利的生防菌及抑菌劑均與其相關(guān)[20-21]，且其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物也有成為抗菌藥物的潛力[22]。

頡頏菌的培養(yǎng)條件往往會對其抗菌效果產(chǎn)生重要影響。同為解淀粉芽孢桿菌，本試驗確定的最適溫度與秦楠等[23]試驗結(jié)果相似，說明此溫度接近頡頏菌最適生長溫度，細(xì)菌生長速度快，代謝旺盛。但最適pH與秦楠等[23]及劉小玉等[24]結(jié)果有所不同，這可能是菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)種類和所抗真菌種類不同導(dǎo)致的。有研究指出細(xì)菌會通過增減堿基來適應(yīng)環(huán)境溫度及pH的變化[25]，這可能會對其蛋白質(zhì)組成及功能產(chǎn)生影響。此外，最佳培養(yǎng)時間、活菌數(shù)及其生長狀態(tài)明顯影響抑菌物質(zhì)產(chǎn)量，死亡細(xì)菌也可能釋放出相應(yīng)化學(xué)成分影響抑菌物質(zhì)活性，這也是接菌量及培養(yǎng)液裝量影響抑菌率的主要原因[26]。本試驗在搖床轉(zhuǎn)速120 r/min時抑菌率最高，但也有高轉(zhuǎn)數(shù)下抑菌效果更好的報道[27]。這可能與頡頏菌對氧氣的需求量有關(guān)。王晶[26]試驗結(jié)果表明培養(yǎng)基種類對不同接菌量下活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響，揭示了各培養(yǎng)條件間的相互作用。所以對于確定菌株的最佳發(fā)酵條件，除了單因素試驗，常通過方差分析選出影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計[23],并應(yīng)用模型綜合評估其對菌株生長的影響[28]，利于進(jìn)一步優(yōu)化菌株發(fā)酵工藝，提高產(chǎn)量，加快試驗進(jìn)程[29]。

對菌株B10作用機制的研究證實，粗提蛋白能明顯抑制菌絲生長，破壞菌絲形態(tài)。馮蓉等[30]及Brown等[31]也發(fā)現(xiàn)了真菌菌絲在活性物質(zhì)作用下的變化。但前者的結(jié)果顯示這一改變影響了真菌生長，后者則是降低了真菌毒力，所以菌株B10最根本的抑菌機制還需深入研究。純化的幾種活性蛋白中，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白[32]和殼聚糖酶[33]是已被證實的能有效頡頏真菌的活性物質(zhì)。他們作用于幾丁質(zhì)和殼聚糖，通過破壞真菌細(xì)胞壁發(fā)揮抗真菌作用。尤其是殼聚糖酶，其高生物降解性、無毒和抗微生物特性使其被廣泛應(yīng)用。除了作為天然生物膜抑制劑直接對抗病原菌[34]，其酶解殼聚糖產(chǎn)生的殼寡糖也具有抗菌及抗氧化活性[35]。其余各蛋白均存在其頡頏真菌的相關(guān)報道(如含F(xiàn)AD/FMN的脫氫酶[36]、枯草桿菌蛋白酶[37]、Cupin家族蛋白[38]及LCI家族蛋白[39])或其作用方式可能會對真菌產(chǎn)生一定影響(如孢子水解酶[40]及細(xì)胞壁水解酶[41])。而這些蛋白的具體作用效果還需通過后續(xù)試驗進(jìn)行驗證。

4 結(jié) 論

本研究分離鑒定出1株抑制黃曲霉菌絲生長的解淀粉芽孢桿菌B10，其最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度40 ℃，培養(yǎng)時間36 h，接種量3%，轉(zhuǎn)速120 r/min，pH 6.0，裝液量30 mL，其抑菌活性成分可能是幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、殼聚糖酶等。