基因治療在肺動脈高壓中的研究進展

李尚, 呂婷婷, 張子睿, 孫嵐

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所藥物篩選中心,北京 100050)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是由多種原因導致的肺循環阻力進行性升高的臨床和病理生理綜合征,它以肺血管重塑為特征,表現為血管內皮細胞異常增殖、平滑肌肥大和內膜增厚,最終右心功能衰竭而死亡。目前對于PAH的臨床治療主要是肺血管擴張藥物,通過選擇性作用于PAH相關分子通路:前列環素通路、內皮素通路與一氧化氮/環磷酸鳥苷通路等,靶向收縮血管,促進肺血管舒張,恢復心肺正常血流供應[1]。肺血管擴張劑雖然可以間接抑制細胞增殖并逆轉血管重塑來緩解癥狀,但安全性低、價格昂貴且不能完全治愈疾病。調查顯示,用藥后患者的生存率并沒有得到很大程度的提高[2]。隨著遺傳學、細胞學、分子生物學、生物信息學等學科的不斷發展,以及對PAH發病機制的不斷深入研究,基因技術作為一門新興的技術,被廣泛地應用于生命科學和醫學研究的重要領域,為改善甚至治愈PAH提供了新的手段。

1 PAH的基因治療

基因治療可通過對基因進行替換、增補或敲除等糾正或補償缺陷和異常基因引起的疾病,達到治療效果。目前,采取基因治療的方法,通過轉移目的表達基因,在體內生成有治療效果的產物如血管舒張因子、細胞生長因子、骨形態發生蛋白2型受體(bone morphogenic protein receptor 2,BMPR2)等是治療PAH的重要方式。此外,研究人員對非編碼RNA與PAH的病理、診斷和治療關系的研究日漸深入,利用長鏈非編碼RNA(long-noncoding RNA,lncRNA)與微小RNA(microRNA, miRNA)相互作用且miRNA可靶向目的基因的特性而產生的非編碼RNA基因療法也逐漸發展起來。PAH基因療法的相關途徑見圖1。

1.1 血管擴張因子

1.1.1 一氧化氮合酶基因療法 一氧化氮(NO)是一種內源性合成的、可擴散的氣體信號分子,在肺循環過程中,參與調節肺血管張力、平滑肌收縮、血小板抑制以及血管重塑等多個生理過程[3]。一氧化氮合酶(NOS) 催化精氨酸氧化是NO的主要來源,其中,肺組織中的NO主要由內皮型NOS(eNOS)催化生成[4]。NO擴散進入肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中,促進GTP轉化為cGMP,使平滑肌細胞舒張,降低肺動脈壓力[3]。NOS3基因轉移對PAH的作用已在多種動物模型中得以研究,如Somani等[5]基于大鼠血液生長內皮細胞(rat blood outgrowth endothelial cells,rBOECs),以逆轉錄病毒為載體過表達eNOS,得到rBOEC/eNOS細胞,尾靜脈注射于野百合堿(monocrotatine,MCT)誘導大鼠PAH模型,結果顯示,與對照組相比,細胞注射組右心室收縮壓降低,右心室肥大、肺小動脈肌化改善。Granton等[6]通過將NOS3基因轉染的內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)經多孔肺動脈導管注入7名WHO Ⅲ級以上癥狀的特發性PAH患者的右心房,發現其總肺阻力有改善,短期血流動力學改善、運動能力持續增加。

AAV:腺病毒；MSCs:間充質干細胞；HVJ:副流感病毒；PECs:肺內皮細胞；VEGF:血管內皮生長因子；VEGFR2:血管內皮生長因子受體2；c-Src:c-Src激酶；TGF-β:β轉化生長因子；BMPR1/2:骨形態發生蛋白受體；HGF:肝細胞生長因子；Met:Met酪氨酸激酶；L-arginine:L-精氨酸；eNOS:內皮型一氧化氮合酶；L-citrulline:L-瓜氨酸；SMAD:SMAD蛋白；AA:花生四烯酸；COX:環氧合酶；PGG2:前列腺素G2；PTGs:前列腺素合酶；PGH2:前列腺素H2；PGIs:前列環素合酶；PGI2:前列環素；PSMCs:肺平滑肌細胞；AC:腺苷酸環化酶；CGRP:降鈣素基因相關肽；GTP:三磷酸鳥苷；cGMP:環磷酸鳥苷；ATP:三磷酸腺苷；cAMP:環磷酸腺苷

1.1.2 降鈣素基因相關肽基因療法 降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是高效的血管擴張劑,可以在受體介導下作用于上皮細胞和平滑肌細胞,激活腺苷酸環化酶生成cAMP,從而舒張血管[7],并可通過抑制肺動脈膠原的積累減緩PAH的進程和肺血管重構[8],在病理生理條件下具有調節肺循環的作用。在多種實驗性PAH模型中,CGRP的基因轉移治療都被證明是有效的。在體外實驗中,Li等[9]分離、體外擴增大鼠PASMCs后用含CGRP的腺病毒進行轉導,表明CGRP的分泌可抑制PASMCs增殖。Zhao等[10]對腹主動脈-下腔靜脈分流術誘導的大鼠PAH模型靜脈注射表達CGRP的EPCs,發現表達CGRP的EPCs移植可有效改善PAH并逆轉肺血管重構。Champion等[11]在小鼠慢性缺氧模型氣管內注射表達CGRP前體的腺病毒,發現小鼠肺血管阻力降低,右心室腫大、肺血管重塑得到改善。

1.1.3 前列環素合酶基因療法 前列環素(prostacyclin, PGI2)是一種由血管內皮細胞產生的高效的內源性血管舒張因子,具有強大的舒張血管、抑制血小板黏附以及抗增殖特性[12]。PGI2是前列環素合酶(PGIs)和環氧合酶(COX)催化內源性花生四烯酸產生的。PGI2可以通過影響PASMCs的增殖和凋亡,逆轉肺血管重構[13],進而阻止PAH的發展。研究證實,在重度PAH患者肺毛細血管中PGIs的表達水平明顯降低[14]。日本研究人員[15]以腺相關病毒(AAV)為載體,通過大腿注射AAV-PGIs,將PGIs轉染到小鼠體內,小鼠肺血管阻力和肺動脈壓降低。同時,小鼠副流感病毒(HVJ)包膜載體系統也應用于PAH大鼠的基因治療,采用HVJ-脂質體法將PGIs轉染到MCT誘導的PAH大鼠氣管內,1周后PGI2的代謝產物顯著增加,大鼠模型PAH顯著改善。Wang等[16]利用超聲波輔助基因轉移在大鼠頜下腺表達Cox1-PGIs,數據顯示循環PGI2顯著升高,大鼠模型PAH同樣得到改善。

1.2 細胞生長因子

1.2.1 血管內皮生長因子基因療法 血管內皮生長因子(VEGF)具有促進內皮細胞增殖、提高血管通透性以及誘導新生血管和小動脈形成等作用[17]。VEGF在肺中含量豐富,可作為肺結構的維持因子來發揮作用。VEGF還可以通過 flk-1、KDR 信號通路激活c-Src激酶,誘導內皮細胞產生NO和PGI2,從而促進血管舒張[18]。實驗研究證明,急性和慢性缺氧會導致肺中VEGF及其受體VEGFR1和VEGFR2表達增加[19],基因導入VEGF可減輕實驗動物PAH的發生。尚峰等[20]將VEGF165轉染的骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植入MCT誘導的大鼠PAH模型中,觀察到肺內損傷血管修復和血管新生現象。Farkas等[21]通過腺病毒載體介導VEGF治療繼發性PAH大鼠,其血管內皮細胞凋亡減少,血管生成增加,PAH顯著改善。

1.2.2 肝細胞生長因子基因療法 肝細胞生長因子(HGF)是目前已知生物活性最廣泛的生長因子之一,能刺激血管內皮細胞增殖和遷移,且HGF具有減弱炎癥細胞浸潤,降低炎癥因子表達,從而減少 PAH 中肺血管壁損傷的功能[22]。HGF通過降低肺動脈壓,減少肺內膜顆粒,繼而延緩右心室肥大、促進內皮細胞修復,最終抑制PAH的發生發展[23-24]。Wang等[25]氣管內滴注HGF腺病毒(Ad-HGF)轉染MCT-PAH大鼠,轉染3周后測定血流動力學指標,HGF能顯著降低PAH、右心室收縮壓、血清血管緊張素Ⅱ和腦鈉肽水平,還明顯減輕了右心室肥大和膠原沉積。此外,Guo等[26]通過BMSCs移植過表達HGF與粒細胞集落刺激因子(G-CSF)聯合治療MCT-PAH大鼠,給藥3周后,聯合治療組的大鼠右心室肥厚和平均肺動脈壓明顯降低,血管肌化及膠原沉積也明顯減少,提示移植HGF-BMSCs聯合G-CSF可協同治療PAH。劉珍君等[24]于MCT誘導的大鼠模型PAH組中氣管滴注攜帶HGF的腺病毒,結果顯示模型組肺動脈壓較大程度降低,肺內膜顆粒減少繼而延緩右心室肥大,促進內皮細胞修復。

1.3 骨形態發生蛋白2型受體基因療法

BMPR2是受體 TGF-β 超家族 “2 型”成員。其常染色體顯性突變存在于大多數可遺傳和家族性 PAH 病例中[27]。磷酸化的BMPR2受體促使1型受體磷酸化,后者又通過經典和非經典信號轉導通路介導受體蛋白SMAD 1/5/8以及細胞外信號調節激酶 (ERK)等的磷酸化,進而促進轉錄因子的表達并激活MAPK、Notch等信號通路,從而影響血管內皮細胞的遷移、增殖和凋亡[28-29]。多項研究表明將野生型 BMPR2 遞送至 MCT誘導缺氧大鼠模型的肺血管內皮可改善 PAH 相關的肺血流動力學參數并逆轉肺血管系統的重塑,如Harper等[30]以腺病毒為載體,將BMPR2遞送進入MCT誘導的大鼠肺高壓模型中,與對照動物相比,大鼠右心室收縮壓和平均肺動脈壓力顯著降低；Harper等[31]在大鼠MCT模型中靜脈注射 BMPR2 表達增強的EPCs,結果顯示該細胞主要在肺部積聚,并釋放表達 BMPR2 的外泌體,PAH導致的右心室肥大、右心室收縮壓以及平均肺動脈壓的升高得到了改善。

1.4 其他目的基因轉移療法

除以上所轉移的目的基因外,近年來,隨著對PAH發病機制及其相關基因通路的不斷深入研究,越來越多的目的基因被用于PAH的基因治療,并在實驗動物模型上取得了良好的治療效果。如Ad5-Kv1.5 經口氣管霧化可以恢復大鼠 PASMCs 對 O2敏感的 K+電流并降低肺血管阻力、改善右心室肥大[32]；骨膜素可以通過NF-кB誘導iNOS基因的表達,并抑制人肺動脈內皮細胞(HPAECs)、人肺動脈平滑肌細胞(HPASMCs)和PAH實驗小鼠模型中生長因子和HIF-1α的釋放以及肺動脈內皮細胞(PAECs)中BMPR2的表達[33-34]；在缺氧誘導的大鼠PAH模型中,選擇性敲低 PAEC-Tph1,抑制了與血管重塑相關的血清素的釋放,逆轉了PAH的發展[35]。除此之外,心房鈉尿肽(ANP)[36]、5-脂氧酶(5-LO)[37]、載脂蛋白A5(ApoA5)[38]、生存素(survivin)[39]、超氧化物歧化酶(SOD)[40]、基質金屬蛋白酶1抑制劑(TIMP-1)等[41]的基因轉移均可減輕大鼠等嚙齒類動物PAH的發生。

1.5 非編碼RNA與PAH

1.5.1 MiRNA與PAH miRNA大多數是由真核細胞RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成的內源性非編碼RNA,既可以通過直接與靶基因信使RNA(mRNA)結合,也可以與靶基因mRNA的3′端非編碼區結合,影響基因的翻譯,在生物的蛋白質合成過程中起到重要的調節作用[42]。近年研究表明,在PAH的發生發展過程中,miRNA可以通過靶向TGF-β、HIF-1、c-myc等重要的信號轉導蛋白影響肺部平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖、遷移和凋亡,以及PAH引起的右心室重構[43-45]。在體外細胞模型中,miR-181a-5p、miR-324-5p在HPAECs中的過表達抑制了細胞的增殖[46]；miR-143-5p直接靶向HIF-1α促進缺氧條件下PASMCs的表型轉換、增殖和遷移[47]。在PAH動物實驗模型中,miR-145敲低的慢性缺氧小鼠模型右心室收縮壓和右心室肥厚顯著降低[48]；慢病毒介導的 miR-150過表達抑制了缺氧誘導的大鼠右心室收縮壓增加和心排出量減少[49]。表1是近5年部分miRNA的靶點及其在PAH中的功能。

表1 miRNA在PAH模型中的靶點基因以及功能

1.5.2 LncRNA與PAH lncRNA與miRNA同屬于非編碼RNA家族,由真核細胞RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成,在PAH的發展過程中,其可以與miRNA結合,發揮分子海綿的作用,產生lncRNA-miRNA-mRNA互作網絡,調控細胞周期以及蛋白合成,進而調控PASMCs的增殖和凋亡。研究表明,lncRNA-Tug1與 miR-374c 結合上調 Foxc1[61],沉默Tug1可以下調 Foxc1從而抑制PASMCs增殖和遷移,同時促進其凋亡；lncRNA-SMILR可以靶向miR-141[62],敲除SMILR顯著抑制MCT誘導的大鼠Rho/ROCK 活化和血管重塑；lncRNA-H19與miRNA let-7b結合[63]上調AT1R,發揮分子海綿作用,敲除H19可抑制小鼠PASMCs增殖,改善MCT誘導的肺血管重塑。除此之外,lncRNA還可以直接調節p53[64]、BRG1[65]、HOXA3[66]等的基因表達,發揮改善PAH的作用。

2 問題和展望

盡管PAH的發病相關基因通路已經得到了廣泛研究,基因治療也在動物實驗模型中取得了一定的治療效果,但在臨床應用上,基因治療仍具有巨大的挑戰。

2.1 基因傳遞系統

將非病毒載體和腺病毒或腺相關病毒載體高效率地通過肺上皮氣管或肺內皮血管輸送到肺部的準確部位,提高靶向性和安全性,克服可能誘發的炎癥和免疫反應,是仍需解決的一大問題。因此,開發高效安全的基因傳遞系統是非常有必要的。

2.2 基因聯合治療

近年來,疾病的聯合用藥發展迅速,用于治療PAH的曲前列環素與ETRA(內皮素受體拮抗劑)、PDE5i(5型磷酸二酯酶抑制劑)或sGC(可溶性鳥苷酸環化酶)刺激劑合用可大大降低心血管意外的發病風險[67]；與單藥治療相比,安立生坦和他達拉非的前期聯合治療可將臨床失敗的相對風險降低 50%[68]；波生坦(口服內皮素受體拮抗劑)和依前列醇(前列腺素)的聯合治療,使患者的血流動力學、運動能力和功能等級都有所改善[69]。可將聯合用藥的思路應用到基因治療中。通過兩種或多種基因的轉移,可以充分利用不同基因產物的特性,在減少相關不良反應發生的同時產生協同治療效果。

總而言之,隨著基因治療技術的不斷發展,其在PAH治療中的價值是不可忽視的,如何進一步解決現有的各種問題并開展后續的臨床試驗,是研究工作的當務之急。相信在不久的將來,基因技術在PAH治療中的運用能取得突破性的進展。