姜黃素對人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其機制

孫俊, 徐偉, 陸榮柱, 朱孝仁, 徐新明, 蔣一全, 陳健

(1. 江蘇大學附屬昆山醫院肝膽外科,江蘇 蘇州 215300； 2. 江蘇大學醫學院,江蘇 鎮江 212013； 3. 南京中醫藥大學附屬鹽城市中醫院病理科,江蘇 鹽城 224001； 4. 江蘇大學附屬昆山醫院中心實驗室,江蘇 蘇州 215300)

內質網是細胞內蛋白折疊及翻譯后加工、脂質合成等重要場所,對維持細胞穩態極為重要；當發生缺氧、pH變化等情況時,大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質蓄積于內質網內,破壞內質網穩態,誘發內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[1-2]。ERS主要有如下3種類型:未折疊蛋白質反應、內質網的超負荷反應、調節固醇元件的結合蛋白激活的固醇級聯反應；其中,未折疊蛋白反應最為多見,故一般情況下ERS指代的就是未折疊蛋白質反應。內質網膜上有3種重要的跨膜傳感器蛋白,分別為需肌醇酶1(inositol requiring enzyme1,IRE1)、蛋白激酶RNA樣內質網激酶(protein kinase RNA-like ER kinase,PERK)和激活轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)。當發生ERS時,3種蛋白分別與葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)解離,識別并結合內質網中積累的未折疊或錯誤折疊蛋白,以對抗應激,維持內質網穩態[2]。當內質網穩態無法維持時,ERS則會誘導細胞凋亡。

原發性肝癌的發病率及死亡率高[3],目前化療藥物的治療效果不理想,且不良反應較大。姜黃素是一種從姜黃的根莖中提取出的天然植物活性成分,能夠明顯抑制乳腺癌[4]、前列腺癌[5]、人膠質母細胞瘤[6]和胰腺癌[7]等腫瘤細胞增殖并促進其凋亡。本課題組前期實驗表明,姜黃素在體外可以通過激活ERS通路,抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡[8]。但是,姜黃素對人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的效應及其潛在機制仍不明確。因此,本研究擬建立裸鼠皮下肝癌移植瘤模型,檢測瘤體組織中ERS相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達情況,并評價姜黃素在體內對肝癌的抑制效應。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞及主要試劑

SPF級BALB/c雌性裸鼠,4周齡,20只,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號為SCXK(滬)2017-0005；人肝癌SMMC-7721細胞株購自湖南豐暉生物科技有限公司；優質胎牛血清購自上海雙洳科技生物有限公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；RPMI 1640培養基購自美國HyClone公司；姜黃素購自美國Sigma公司；兔抗鼠GRP78、IRE1和β-微管蛋白抗體購自美國Abcam公司；兔抗鼠磷酸化PERK(p-PERK)抗體購自北京博奧森生物公司；兔抗鼠磷酸化真核細胞起始因子2α(phospho-eukaryotic initiation factor 2α,p-eIF2α)、Bcl-2、Cleaved Caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)抗體購自杭州華安生物技術有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG抗體購于美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、分離膠配制試劑盒均為上海碧云天生物公司產品；DAB染色液、蘇木素染色劑、免疫組化抗原修復試劑盒均為上海桂浦生物科技有限公司產品。

1.2 細胞培養與傳代

將人肝癌SMMC-7721細胞株用含10%優質胎牛血清及1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI 1640培養基,培養于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中。傳代次數在10代以內。

1.3 裸鼠皮下肝癌移植瘤模型的建立

取傳代后處于對數生長期的人肝癌SMMC-7721細胞,胰蛋白酶消化后離心,用PBS重懸,定量細胞密度至2×107個/mL。取100 μL肝癌細胞(約2×106個)接種于裸鼠右側腋下,繼續在SPF環境中飼養至實驗結束。接種第5天,所有受試裸鼠皮下均可見一個明顯、清晰的結節,其邊界清晰,質地較硬,可推動。由此可證實人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤模型構建成功。

1.4 動物分組及處理

待裸鼠皮下腫瘤組織最長徑均大于5 mm后,將20只成瘤裸鼠隨機均分為4組,即對照組、10 mg/kg姜黃素組、50 mg/kg姜黃素組、100 mg/kg姜黃素組,每組5只。均采用腹腔注射給藥,分別給予生理鹽水及對應劑量姜黃素,每日給藥1次,每次200 μL,連續16 d。

1.5 指標測量

自給藥當天起,每隔一日測量各組裸鼠體重及裸鼠皮下移植瘤的最長徑a(mm)和最短徑b(mm),采用公式V(mm3)=ab2/2計算皮下移植瘤體積。同時觀察各裸鼠的神經行為及營養狀況。給藥結束后第2天,給予所有裸鼠2%水合氯醛麻醉,完整剝離腫瘤組織,PBS清洗,濾紙吸干水分后測量瘤體重量,并計算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-姜黃素組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.6 蛋白質免疫印跡法檢測瘤體組織中ERS通路相關蛋白及凋亡蛋白表達

稱取各組瘤體組織,每20 mg組織加入150 μL RIPA裂解液,研磨、離心后提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。配制8% SDS-PAGE分離膠,80 V電泳分離蛋白90 min；300 mA轉膜90 min至PVDF膜；5%奶粉室溫封閉2 h；將PVDF膜加入對應的一抗稀釋液中(GRP78、IRE1、p-PERK、p-eIF2α、CHOP、Cleaved Caspase-3及Bcl-2抗體稀釋比均為1 ∶1 000；內參為GAPDH或β-微管蛋白,稀釋比為1 ∶1 000)；TBST洗滌3次；加入二抗稀釋液(1 ∶10 000),室溫孵育1 h；TBST洗滌；膜上滴加熒光試劑ECL,經凝膠成像系統顯影。取目的條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.7 免疫組織化學法檢測瘤體組織中GRP78和IRE1蛋白表達

取出液氮中瘤體組織,切取部分組織標本,用10%甲醛液固定脫水,常規石蠟包埋,制備4 μm連續切片。60 ℃烘烤1 h；經二甲苯脫蠟3次,每次10 min；再經從高到低濃度梯度的乙醇浸泡、水化,每次5 min；將pH=6.0抗原修復試劑置于微波爐中高火加熱5～6 min,放入載玻片后轉中高火修復15 min；將配好的3%過氧化氫滴加于切片,室溫孵育15 min；PBS清洗3次；滴加山羊血清后室溫封閉30 min棄去上清液；分別加入GRP78和IRE1一抗稀釋液(1 ∶500),4 ℃孵育過夜；加二抗稀釋液(1 ∶200),孵育30 min；清洗5 min,甩干；加入DAB溶液顯色,雙蒸水沖洗,蘇木素染色液復染10 s；脫水、透明后中性樹脂封片。

在普通光學顯微鏡(×400)下,隨機選取5個不同視野,計數細胞總數及陽性細胞數,按陽性細胞所占的百分比計分。評分方法如下:① 按陽性細胞率計分:陽性率≤10%計1分,10%～50%計2分,50%～75%計3分,≥75%計4分；② 按染色程度評分:陰性1分,弱染色2分,中等強度染色3分,強染色4分。由兩位病理科醫師在雙盲情況下觀察記分；將兩種方法計得分數的乘積用來判斷結果,即:陰性(-)為≤4分,弱陽性(+)為5～8分,陽性(++)為9～12分,強陽性(+++)為>12分[9]。

1.8 數據分析

2 結果

2.1 姜黃素處理對荷瘤裸鼠行為及體重的影響

在整個給藥期間,不同劑量姜黃素組受試裸鼠行為未發現異常,營養狀態良好；4組裸鼠體重均呈逐漸增長趨勢。對照組裸鼠體重增加略高于各姜黃素處理組,但各組裸鼠體重增長并沒有明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組裸鼠體重變化比較

2.2 姜黃素對裸鼠移植瘤體積的影響

由圖2可見,隨著給藥時間延長,各組裸鼠瘤體體積均呈增大趨勢。但第10天,100 mg/kg姜黃素組瘤體體積明顯小于對照組及10 mg/kg姜黃素組(P均<0.05)；自第12天起,50 mg/kg和100 mg/kg姜黃素組瘤體體積均明顯小于對照組及10 mg/kg姜黃素組(P均<0.05),且100 mg/kg姜黃素組明顯小于50 mg/kg姜黃素組(P均<0.05)。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

2.3 姜黃素對瘤體重量及抑瘤率的影響

隨著姜黃素劑量增加,各組中瘤重逐漸降低,100 mg/kg姜黃素組瘤重較50、10 mg/kg姜黃素組分別降低35.4%、16.5%。與對照組相比,10、50和100 mg/kg姜黃素組裸鼠移植瘤瘤重明顯降低(q=4.067、5.258、6.289,P均<0.05)。10、50和100 mg/kg姜黃素組抑瘤率分別為35.3%、45.7%、54.7%。見圖3。

a:P<0.05,與對照組比較

2.4 姜黃素對移植瘤中ERS通路相關蛋白及凋亡相關蛋白表達的影響

2.4.1 姜黃素對移植瘤中ERS通路標志性蛋白GRP78表達的影響 與對照組相比,姜黃素組GRP78蛋白表達均出現增加趨勢,且50和100 mg/kg姜黃素組GRP78表達量明顯高于對照組(q=6.426、11.190,P均<0.05)；100 mg/kg姜黃素組GRP78表達量顯著高于10和50 mg/kg姜黃素組(q=7.799、6.769,P均<0.05)。見圖4。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

2.4.2 姜黃素對移植瘤中未折疊蛋白反應下游通路蛋白表達的影響 與對照組相比,姜黃素組中p-PERK和p-eIF2α表達量均顯著增加(P均<0.05),且各劑量組間p-PERK蛋白表達差異均有統計學意義(P<0.05),呈一定的劑量依賴性。與對照組及10 mg/kg姜黃素組相比,IRE1在50、100 mg/kg姜黃素組中表達明顯增加(P均<0.05),且100 mg/kg姜黃素組明顯高于50 mg/kg姜黃素組(q=6.713,P<0.05)。CHOP在50、100 mg/kg姜黃素組中表達水平較對照組明顯增加(q=5.473、10.160,P均<0.05),且100 mg/kg姜黃素處組明顯高于10、50 mg/kg姜黃素組(q=6.822、4.688,P均<0.05),10、50 mg/kg姜黃素組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

2.4.3 姜黃素對移植瘤凋亡相關蛋白表達的影響 免疫印跡結果顯示,與對照組比較,10、50和100 mg/kg姜黃素組中抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減少(P均<0.05),50和100 mg/kg姜黃素組凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表達明顯增加(q=5.631、10.160,P均<0.05)；與10 mg/kg姜黃素組比較,50和100 mg/kg姜黃素組中Cleaved Caspase-3表達亦明顯增加(q=4.850、9.375,P均<0.05)。見圖6。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較

2.5 姜黃素對瘤體組織中GRP78和IRE1表達的影響

免疫組化染色結果顯示,與對照組比較,10、50、100 mg/kg姜黃素組中GRP78和IRE1蛋白陽性表達評分明顯增加(P均<0.05),且各劑量組間GRP78和IRE1陽性表達評分差異均具有統計學意義(P均<0.05),呈一定的劑量依賴性。見圖7。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與10 mg/kg姜黃素組比較；c:P<0.05,與50 mg/kg姜黃素組比較

3 討論

本研究采用人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠皮下移植瘤作為研究模型,實驗中所有裸鼠均植瘤成功,成瘤率為100%。此外,隨著用藥時間延長,所有組別裸鼠體重都呈緩慢上升趨勢,其體重增加無明顯差異；未發現各組裸鼠有消瘦或生長活動異常情況。由此表明,在一定時間內姜黃素用藥對裸鼠自身生長無明顯影響,可能是一種相對安全的藥物。

本研究發現,10、50、100 mg/kg姜黃素組移植瘤體積和瘤重均明顯小于對照組,表明姜黃素能有效抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤生長。10 mg/kg姜黃素組移植瘤體積與對照組比較差異無統計學意義,可能是姜黃素劑量過低,導致其對腫瘤抑制作用不如50、100 mg/kg姜黃素組,但10 mg/kg姜黃素組移植瘤體積增長幅度仍小于對照組。本研究結果與戴莉等[10]相一致,由此表明,就瘤重而言,所用姜黃素劑量越高,抑瘤效果越明顯。

ERS激活是誘導腫瘤細胞凋亡的重要機制之一[11-12]。大量研究表明姜黃素可能是通過激活ERS通路進而破壞腫瘤細胞的內質網穩態達到抗癌目的[13-15]。Zhang等[16]發現姜黃素通過破壞細胞內Ca2+穩態來激發ERS誘導人乳頭狀甲狀腺癌BCPAP細胞凋亡。本課題組前期研究也證實姜黃素能在體外通過激活ERS來誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡[8]。本研究發現,50和100 mg/kg姜黃素處理組ERS標志性蛋白GRP78蛋白表達明顯上調,而在10 mg/kg姜黃素組中該蛋白表達較對照組有升高趨勢,但是差異無統計學意義,可能提示藥物劑量較低,導致ERS雖已激活,但作用不強烈,從而對腫瘤抑制效果不明顯。Yang等[17]研究表明,雖然25 mg/kg姜黃素抗前列腺腫瘤效果與對照組相比有差異,但是其抗癌效果不如50、100 mg/kg姜黃素組,究其原因可能是較低劑量的姜黃素不足以刺激腫瘤細胞產生過于持續而強烈的ERS。

當發生ERS時,PERK與GRP78解離后迅速自磷酸化,磷酸化的PERK具有更強的活性。本實驗中p-PERK在3個姜黃素組中表達均較對照組明顯上調,且呈一定的劑量依賴性。p-PERK介導eIF2α磷酸化,p-eIF2α活性遠大于eIF2α且相對更容易檢測。在劉沙等[18]研究中,重組新城疫病毒在抑制肺癌移植瘤增長的同時,致瘤體組織內p-eIF2α表達明顯增加,證實裸鼠腫瘤細胞內發生ERS。本實驗中p-eIF2α在各姜黃素組中表達均較對照組明顯增加,其中50 mg/kg姜黃素組表達高于10 mg/kg姜黃素組,但差異無統計學意義,可能由于50 mg/kg姜黃素對活性更強的p-eIF2α蛋白激活效應仍不夠強烈。未折疊蛋白反應另一感受器蛋白IRE1在10 mg/kg姜黃素組中的表達與對照組比較差異無統計學意義,表明該劑量無法刺激細胞產生過強的ERS。相對IRE1通路而言,PERK通路可能對低劑量的姜黃素更敏感。在郭立達等[19]研究中,單獨使用50 mg/kg姜黃素能較好地抑制結腸癌裸鼠移植瘤生長；同時還發現,姜黃素和奧沙利鉑聯用可協同抗癌,抑瘤效果更好。在本實驗中,ERS通路相關蛋白在50 mg/kg姜黃素組中表達量明顯高于對照組,提示50 mg/kg可能為姜黃素有效抗癌劑量。最后免疫組化結果輔助證實ERS相關蛋白GRP78和IRE1陽性表達隨著姜黃素劑量增大而增加,與蛋白免疫印跡結果基本一致,提示ERS抑制腫瘤生長。

Caspase-3是Caspase級聯反應中最關鍵的細胞凋亡執行因子,而Bcl-2作為Caspase-3上游的調控因子,在細胞中具有明顯的抗凋亡作用[20-22]。本實驗結果顯示,經過姜黃素作用后Bcl-2表達較對照組明顯降低,雖然3個姜黃素組間表達并無明顯差異,但是隨著姜黃素劑量增大,Bcl-2表達量呈下降趨勢。后續實驗中可測定Bax表達水平,計算Bcl-2與Bax表達水平的比值,以便更好地闡釋在姜黃素作用下Bcl-2對細胞凋亡的調控[19]。此外,本研究結果顯示,50、100 mg/kg姜黃素組中Cleaved Caspase-3表達明顯高于對照組和10 mg/kg姜黃素組,提示在50、100 mg/kg劑量時,姜黃素促進腫瘤細胞凋亡的作用明顯,且呈一定的劑量依賴性。CHOP是未折疊蛋白反應中介導細胞凋亡的關鍵蛋白,且其與未折疊蛋白反應的3個通路均有關[23]。在姜黃素作用下,CHOP信號通路被激活,同時Bcl-2表達下調引發線粒體外膜通透性改變,繼而釋放細胞色素C,進而釋放凋亡小體,活化Caspase-9,產生級聯反應,最終活化Caspase-3,誘導腫瘤細胞凋亡[24-26]。本實驗發現,50、100 mg/kg姜黃素組中CHOP表達明顯高于對照組及10 mg/kg姜黃素組,而10 mg/kg姜黃素組CHOP表達雖較對照組有上升趨勢,但是差異無統計學意義；由此提示,當姜黃素劑量大于50 mg/kg時,可激活ERS的關鍵蛋白CHOP,進而促進肝癌細胞凋亡,這也印證了前文所述的推測,即50 mg/kg可能是姜黃素的最低抗癌有效劑量。此外,敲除或過表達ERS相關基因后姜黃素在體內抗肝癌的效果有待進一步探索。同時,姜黃素與臨床上常用的其他與ERS相關抗肝癌化療藥物聯合應用的抗癌效果亦有待研究。

綜上所述,本研究結果表明,姜黃素可抑制人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤生長,其機制可能與激活ERS通路有關,進而通過共同的CHOP途徑抑制下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、增強凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表達來抑制肝癌細胞增殖,促進其凋亡。