富含亮氨酸重復序列蛋白 1 通過上調哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達促進乳腺癌細胞遷移和侵襲

王樂, 朱孝仁, 彭詩晴, 陳敏斌

(1. 江蘇大學醫學院,江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇大學附屬昆山第一人民醫院腫瘤科,江蘇 昆山 215300)

乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤[1-2]。乳腺癌轉移是長期以來腫瘤基礎和臨床研究的重要癌癥特征[3]。研究發現,在最初診斷和治療后的幾個月或幾年內,乳腺癌細胞可以轉移至其他部位[4-7],如肝臟[8]、大腦[9]、骨骼[10]或肺部[11]等。另有研究表明,伴有遠處轉移的乳腺癌患者預后差[12],復發率高[13],生存期短[14]。目前認為,多個促癌基因過度表達及活化是發生乳腺癌浸潤、轉移和進展的主要原因[15-16]。

富含亮氨酸重復序列蛋白1(leucine-rich repeat protein 1, LRR1) 基因所編碼的蛋白質含有一個富含亮氨酸的重復序列,對于腫瘤轉移的調控具有重要作用[17]。臨床研究表明,LRR1在侵襲性胃癌患者血清中呈高表達[18]。另有研究發現,LRR1長鏈非編碼 RNA 可以促進胃癌侵襲[19]。目前,關于LRR1和乳腺癌轉移間的相關性尚不清楚,本研究擬以乳腺癌 MDA-MB-231、HCC70 細胞株為研究對象,探討LRR1對乳腺癌細胞的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器

人乳腺上皮MCF-10A細胞系購于上海富衡細胞庫；人乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞系購于上海生命科學研究院細胞資源中心。PBS、胎牛血清(美國Hyclone公司)；HitransG病毒感染試劑 (A/P) 購自上海吉凱基因科技有限公司；逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；四甲基乙二胺(碧云天生物技術有限公司)；MEM、1%青霉素/鏈霉素、胰酶、溴酚藍、二甲基亞砜、Triton X-100 (美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒、離心機、CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(山東博科生物產業有限公司)；凝膠成像儀(美國Analytikjena公司)；電泳上樣緩沖液、TEMED(碧云天生物技術有限公司)；脫脂奶粉(美國BD公司)；PVDF 膜(美國Millipore公司) ；兔抗人LRR1、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, m-TOR)、β-肌動蛋白一抗,羊抗兔二抗(英國Abcam 公司)。轉染序列均由吉凱基因公司合成。

1.2 細胞培養、分組及慢病毒轉染

1.2.1 細胞培養 在培養基中加入100 ng/mL霍亂毒素配制成完全培養基,于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養人乳腺上皮MCF-10A 細胞；用含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的 DMEM,于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養人乳腺癌 HCC70 和 MDA-MB-231 細胞。

1.2.2 細胞分組及轉染 取“1.2.1”乳腺癌MDA-MB-231和HCC70細胞,分為干擾對照組、LRR1干擾組、LRR1過表達組和空載體對照組,分別轉染LRR1干擾對照序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)、LRR1干擾序列(GTGGTCTTAGTAGATAATT)、LRR1過表達序列(AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAAGCTACACTGTGAGGTGGAG)和空載體序列(TCCTTGTAGTCCATACCCTTTAACATATCAGAGGAATT-AACATAAC)。每孔加入適量完全培養基,接種于6孔板,每孔細胞數5×105個,培養12 h左右；取1.5 mL無酶EP管,加入100 μL無血清培養基,再加入2 μL Lipofectamine 2000并輕輕混勻配置成a液；取無菌1.5 mL EP管,加入100 μL無血清培養基,加入LRR1干擾序列或者干擾對照序列,混勻配置成b液；再加入LRR1過表達序列或者空載體對照序列,混合配置成c液,將a、b液以及a、c液混合,室溫放置20 min形成轉染復合物；當細胞密度達30%～50%時,每孔加入200 μL轉染復合物,置于細胞培養箱中培養48 h。

1.3 Transwell 實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

取“1.2.2”4組轉染細胞接種于24孔板,培養過夜；每孔加入0.6 mL含10%胎牛血清的 DMEM, 37 ℃孵育過夜；胰酶消化并離心；取0.2 mL細胞混懸液沿著Transwell 小室的側壁勻速注入標記好的相應24孔板中,靜置2 min；37 ℃培養24 h；10%甲醇固定15 min；0.1%結晶紫染色30 min；光鏡下觀察膜背面侵襲細胞數。

1.4 Transwell 實驗檢測乳腺癌細胞侵襲能力

取“1.2.2”轉染細胞接種于24孔板,培養過夜；每孔加入0.6 mL預熱的含有10%胎牛血清的DMEM, 37 ℃孵育過夜；每孔用預冷的槍頭吸取0.03 mL Matrigel 膠沿著小室側壁緩慢注入Transwell 小室；37 ℃孵育2 h；胰酶消化并離心；加入4 mL含有1%胎牛血清的DMEM進行重懸,取細胞混懸液加入Transwell小室底部,靜置2 min；于37 ℃孵育24 h ；PBS清洗2次；每孔加入1 mL細胞固定液常溫固定30 min；PBS清洗2次；每孔加入1 mL結晶紫常溫染色30 min；PBS清洗3次；小室自然風干；刮除小室上層未穿過小室孔膜的乳腺癌細胞；光鏡下觀察膜背面侵襲細胞數。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測乳腺癌細胞LRR1和m-TOR蛋白表達

1.5.1 LRR1蛋白表達檢測 取“1.2.1”乳腺癌MDA-MB-231和HCC70細胞和人乳腺上皮MCF-10A細胞,接種于6孔板,保證細胞數>1×106個,置于冰上,每孔按照細胞數加入0.09 ～ 0.15 mL細胞裂解液,裂解細胞15 min；12 000 r/min離心15 min,BCA法蛋白定量；行10% SDS-PAGE,80 V電泳,當蛋白條帶至分離膠時換成110 V,電泳2 h左右；110 V轉膜2 h至PVDF膜；10%脫脂牛奶4 ℃封閉120 min；分別加入兔抗人LRR1抗體、β-肌動蛋白抗體(內參),均 1 ∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜；1% PBST洗膜3次；4 ℃孵育二抗(1 ∶1 000稀釋)2 h；ECL液曝光和顯影,Image J軟件進行灰度掃描,計算目的條帶的相對灰度值。

1.5.2 m-TOR蛋白表達檢測 取“1.2.2”轉染細胞,檢測m-TOR蛋白表達,其中兔抗人m-TOR蛋白1 ∶1 000稀釋,其余方法同“1.5.1”。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 LRR1在人乳腺癌細胞中呈高表達

蛋白免疫印跡結果顯示,人乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞中LRR1表達顯著高于人乳腺上皮MCF-10A細胞(t=-13.472,-12.270,P均<0.01)。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測不同乳腺細胞中LRR1表達

2.2 LRR1對乳腺癌細胞遷移能力的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組細胞遷移數明顯減少(t=18.939,10.070,P均<0.01)；與空載體對照組相比,LRR1過表達組細胞遷移數明顯增加(t=-22.840,-33.954,P均<0.01)。見圖2。

圖2 各組乳腺癌細胞遷移能力比較(×100)

2.3 LRR1對乳腺癌細胞侵襲能力的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70 細胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組細胞侵襲數明顯減少(t=18.059,6.860,P均<0.01)； 與空載體對照組相比,LRR1過表達組細胞侵襲數明顯增加(t=-24.050,-12.072,P均<0.01)。見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力(×100)

2.4 LRR1對乳腺癌細胞m-TOR 表達的影響

在乳腺癌MDA-MB-231、HCC70細胞中,與干擾對照組相比,LRR1干擾組m-TOR表達水平顯著降低(t=7.804,7.496,P均<0.01)；與空載體對照組比較,LRR1過表達組m-TOR表達水平明顯增高(t=-10.405,-7.031,P均<0.01)。見圖4。

圖4 蛋白印跡實驗檢測各組細胞m-TOR蛋白表達

3 討論

以往研究發現,LRR1高表達與乳腺癌患者不良預后相關[20]。本研究結果發現,LRR1在乳腺癌細胞中呈高表達,與之前報道一致[21]。由此提示,LRR1可能作為乳腺癌新的診斷分子標志物,其高表達極有可能參與調控乳腺癌的發生發展。此外,本研究結果顯示, LRR1高表達可促進乳腺癌細胞遷移和侵襲,由此提示,在乳腺癌進展中,LRR1可能作為促癌因子發揮作用。然而,在腎細胞癌中LRR1高表達則抑制腫瘤進展[22],這可能與腫瘤的異質性以及不同的分子調控機制有關。

LRR1可通過參與蛋白質的泛素化過程和蛋白酶體降解[23-24],進而影響細胞的生物學功能。本研究發現,LRR1干擾后m-TOR表達顯著降低；而過表達則相反；由此提示LRR1可能通過調節m-TOR表達促進乳腺癌侵襲和轉移。既往研究發現,m-TOR異常活化可促進前列腺癌細胞轉移[25]；另有研究表明激活細胞外調節蛋白激酶(ERK)/m-TOR信號通路可以促進肝癌細胞轉移[26]。然而,LRR1是否直接靶向調節m-TOR表達促進乳腺癌的轉移尚未明確,具體機制有待后續深入研究。

綜上所述, LRR1可能作為促癌因子通過調節m-TOR表達進而調控乳腺癌細胞的遷移和侵襲。但是,本研究僅在體外乳腺癌細胞中進行,后續有待在臨床樣本中研究LRR1對乳腺癌的診斷價值。此外,LRR1與m-TOR在乳腺癌中的生物學功能以及相關信號轉導通路的激活有待后續進一步研究。