β-catenin和PD-L1在非小細胞肺癌的表達及其臨床意義分析

林允斌 李小霞 盧愛薇 卓德祥 朱虹 羅碧琚 陳龍 肖首浩

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，不論在病死率還是在惡性腫瘤死因構成比中，肺癌都呈現逐步上升的趨勢[1]。按組織學分類，肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占肺癌總數的80%[1]，且惡性程度較高。目前，NSCLC的治療方式主要包括手術治療、放療、化療以及分子靶向治療[2]，手術切除是目前肺癌較為常見的常規治療方法，然而對于晚期無法手術的NSCLC患者，以鉑類為基礎的化療仍然是治療的主流，盡管鉑類化療和靶向治療顯示出優越的治療效果，但二者存在耐藥或者基因突變陰性等治療的局限性，且非小細胞性肺癌的5年生存率仍僅為4%～17%，肺癌的早期診斷和治療是臨床醫生和科研工作者共同面對的難題，尤其是難治性NSCLC患者的新療法仍亟待挖掘[3-4]。近幾年來，繼腫瘤分子靶向治療之后，腫瘤的免疫治療成為新的熱點，其中以程序性死亡受體1（programmed cell death-1，PD-1）及其配體程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）為免疫抑制點的免疫治療藥物在臨床藥物試驗中顯示了較好的療效和耐受性[5-6]，腫瘤細胞高表達的PD-L1和免疫T細胞表面的PD-1結合后抑制機體的免疫應答，促進了腫瘤的進展和轉移，通過阻斷PD-1/PD-L1通路，可恢復機體的抗腫瘤免疫，達到腫瘤免疫治療的效果[7]。Wnt信號通路廣泛參與人類腫瘤的發生發展和腫瘤耐藥[8-10]。近年研究表明，Wnt信號通路參與了腫瘤的免疫逃逸，從而減弱了免疫治療的效果[11-12]。國內外已經對腫瘤中多種信號通路調控PD-L1的表達做了詳細的研究，Lorenzo等[13]的研究表明，在三陰性乳腺癌中，Wnt信號通路參與了PD-L1的表達調控，但是在NSCLC中Wnt信號通路對PD-L1的調控尚無報道。本研究旨在通過實時熒光定量PCR和免疫組化的方法研究非小細胞癌中β-catenin和PD-L1mRNA和蛋白質的表達，分析二者之間表達水平的關聯，探討NSCLC中Wnt/β-catenin信號通路參與調控PD-L1的表達進而影響NSCLC的免疫調節的可能性，并為PD-L1抗體在NSCLC的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床腫瘤標本

本研究NSCLC腫瘤組織標本來源于2016年1月—2019年1月在三明市第一醫院接受手術治療的NSCLC患者。手術離體腫瘤組織標本和對應癌旁組織標本使用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。本研究經三明市第一醫院醫學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

組織總RNA提取按照Trizol（Invitrogen）試劑說明進行。總RNA 2 μg反轉錄為cDNA并進行實時定量PCR檢測。引物如下：β-catenin（up）5′ -CTGCGAGGAGAAGATGGTTA-3′，β-catenin（down）5′ -CTTTGCACAAGTCTCCCAAC-3′；PD-L1（up）5'-CTGCATGATCAGCTATGGTGGTG-3'，PD-L1（down）5'-CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA-3'；GAPDH（up）5′-AGAAAAACCTGCCAAATATGATGAC-3′。基因的表達變化用2-ΔΔCt法計算，GAPDH為內參。

1.3 免疫組化

將甲醛固定的石蠟切片先后經二甲苯脫蠟、分級酒精水化，微波中檔修復10 min，3% H2O2阻斷內源性過氧化酶15 min，5%正常血清37℃封閉30 min，一抗4℃孵育過夜（PD-L1抗體1∶25稀釋，β-catenin抗體1∶3 000稀釋），辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育30 min，使用新鮮配制的DAB顯色，顯微鏡下觀察結果，細胞漿、細胞膜或細胞核可見棕黃色顆粒為陽性，400倍光鏡下隨機選取10個視野，計算1 000個腫瘤細胞中陽性細胞所占比率，≥10%為陽性，＜10%為陰性；染色強度按陰性、弱、中和強染色評為0～3分。

1.4 統計學分析

用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。計數和計量資料分別用率（%）和（）表示，分別采用χ2及t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。計量資料比較采用Student's t檢驗。相關性采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 NSCLC組織β-catenin和PD-L1 mRNA表達相關分析

為探討NSCLC組織中β-catenin和PD-L1 mRNA表達情況，本研究用實時定量PCR方法檢測NSCLC組織和配對的癌旁組織β-catenin和PD-L1 mRNA表達，如圖1A和圖1B顯示，和配對的癌旁組織比較，絕大多數（27/30）NSCLC組織中β-catenin和PD-L1 mRNA表達均明顯升高。Pearson相關分析顯示，NSCLC組織中β-catenin mRNA表達升高倍數和PD-L1 mRNA表達升高倍數呈明顯正相關。見圖1。

圖1 NSCLC組織中β-catenin和PD-L1 mRNA表達

2.2 NSCLC組織β-catenin和PD-L1蛋白表達水平分析

為進一步探討NSCLC組織中β-catenin和PD-L1蛋白表達情況及相互關系，采用免疫組化方法分別檢測連續的癌組織切片中β-catenin和PD-L1的蛋白表達，在β-catenin表達弱的非小細胞癌組織中PD-L1表達也弱，β-catenin表達強的癌組織中PD-L1表達也相應較強。見圖2。

圖2 NSCLC組織中β-catenin和PD-L1蛋白表達

3 討論

據世界衛生組織（WHO）下屬的國際癌癥研究機構（IARC）公布的數據顯示，2020年全球新發肺癌病例大約為220.7萬例，發病率居惡性腫瘤第2位[14-15]，而在中國，肺癌是目前發病率和病死率最高的惡性腫瘤[16]，其中NSCLC是臨床中最為常見的肺癌類型之一。NSCLC的發生、發展和轉歸是一個復雜的且由多種因素共同參與的過程[17]，其中較為經典的有Wnt/β-catenin信號通路的異常激活和肺癌細胞表達PD-L1參與免疫逃逸。

Wnt信號通路是與腫瘤的發生發展密切相關的一類信號通路，Wnt信號通路通過調節細胞的增殖、分化、轉移、極性、黏附等，參與很多發育過程，如胚胎發育，組織完整性，體軸模式，機體干細胞維持等。在正常成熟的細胞中，Wnt信號通路處于閉合狀態。Wnt信號通路分為經典的β-catenin依賴性途徑和非經典的β-catenin非依賴性途徑[18]。本研究提及的Wnt/β-catenin信號通路即為經典Wnt信號通路[19]。β-catenin是Wnt信號通路的重要調節蛋白，當Wnt信號通路異常激活時，其由細胞漿轉入細胞核，調節靶基因的表達并進一步促進細胞的增殖。Wnt/β-catenin信號通路已被證實在多種腫瘤細胞中異常表達，可廣泛參與人類腫瘤的發生、發展和腫瘤耐藥[8-10]，在參與肺癌發生發展的諸多信號通路中，Wnt/β-catenin信號通路對肺癌的調控較為直接且復雜，是肺癌發生發展過程中較為重要的因素之一，其在NSCLC中呈現高表達的狀態，在NSCLC的進展與轉移中起到關鍵性作用[19-20]。

PD-1是一種細胞表面受體，在活化的T細胞上高表達，被認為是T細胞衰竭的標志，它可以調節T細胞的活性，激活腫瘤特異性T細胞的凋亡，抑制調節性T細胞的凋亡，從而抑制免疫反應并促進自我耐受[21]。PD-L1是一型跨膜蛋白，可在某些腫瘤細胞和抗原提呈細胞表達，是一種免疫反應的共抑制因子[22]，其功能與免疫系統的抑制有關。PD-1與其配體PD-L1結合后，其碳端免疫受體酪氨酸基開關基序發生磷酸化，募集蛋白酪氨酸磷酸酶Src同源蛋白2，使下游的脾酪氨酸激酶和磷脂酰肌醇3激酶發生去磷酸化，從而傳遞抑制性信號，發揮負性調節作用[2，23-25]。PD-1/PD-L1在腫瘤細胞的高表達促使腫瘤細胞的抗原性降低，機體的免疫系統對腫瘤細胞的識別能力降低，導致抗腫瘤水平下降，促使了腫瘤的發展。馬薇等[26]發現PD-L1在47例NSCLC患者的癌細胞及癌間質淋巴細胞和巨噬細胞的表達陽性率水平與肺癌的臨床分期、淋巴結轉移呈正相關，與患者的預后生存呈負相關，提示PD-1/PD-L1信號通路可能參與了NSCLC的發展進程。

本研究應用實時熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫組織化學方法分別探討NSCLC組織及其癌旁組織中β-catenin和PD-L1在mRNA水平和蛋白水平的表達情況，結果發現NSCLC組織中β-catenin和PD-L1的表達均較其癌旁組織明顯升高，且二者的mRNA表達水平呈明顯的正相關，這個結果也在蛋白水平中得到了驗證。根據獲得的研究結果本研究推測，在NSCLC中Wnt/β-catenin信號通路激活后可能有相關基因參與調控PD-L1的表達，而高表達的PD-L1與腫瘤浸潤T淋巴細胞表面的PD-1結合，降低了腫瘤局部微環境中T細胞的免疫效應，從而介導NSCLC免疫逃逸的發生，促進NSCLC的進展。

綜上所述，本研究結果表明Wnt/β-catenin信號通路的激活可能會誘導NSCLC中PD-L1的表達，而PD-L1又參與了NSCLC的免疫逃逸過程。因此，本研究猜測抑制Wnt/β-catenin信號通路可能會導致PD-L1表達量的減少，并且可能會降低NSCLC免疫逃避的發生，這為NSCLC的免疫療法提供了新的思路。然而，本研究僅顯示Wnt/β-catenin信號通路可能參與調控PD-L1的表達，因實驗方法的局限性，仍存在許多的不足，還需進行更為深入、嚴謹的實驗來探究Wnt/β-catenin信號通路可能存在的促進PD-L1表達的分子機制，為Wnt/β-catenin信號通路參與調控PD-L1的表達提供更為可靠的證據。雖然免疫療法在一些腫瘤的治療中取得了初步的進展，但是未來臨床醫生和科研工作者將面臨更多的問題和挑戰，需要進行更為深入、嚴謹的基礎研究并將其進行臨床轉化，最大限度地為每一位腫瘤患者提供提高生存率和生存質量的診療服務。