基于腸腎軸理論探討中藥序貫式結腸透析對CKD大鼠腸道菌群的影響*

張 然 張雪琴 張曉艷 郭 鴻 郭阿霞 孫 茹 牛春蘭

慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)是各種原因引起的腎臟結構和功能障礙≥3個月，包括腎小球濾過率(Glomerular filtration rate，GRF)正常和不正常的病理損傷、血液或尿液成分異常，及影像學檢查異常；或不明原因的GRF下降(<60 ml/min)超過3個月[1]。有學者對中國CKD的流行病學進行了一個橫斷面研究，發現中國成年人群CKD的患病率為10.8%，由此推測中國CKD的人數為1.195億[2]。中藥序貫式結腸透析是近年發展起來治療CKD的方法之一，其配合現代醫學常規治療，可減輕早中期慢性腎功能衰竭患者的臨床癥狀[3]。因其價廉、方便易操作、適用范圍廣、安全等優勢，越來越被重視[4]，并開始在中醫院推廣應用。近年來，越來越多的證據顯示，腸道菌群失調(Intestinal microbes dysbiosis)是CKD患者進展至尿毒癥的高危因素之一[5]。2011年，Meijers等[6]首次提出了腎臟與腸道相互作用的“腸-腎軸(Gut-kidney axis)”學說。在此基礎上，2015年，Pahl等[7]提出“慢性腎臟病-結腸軸(Chronic kidney disease-colonicaxis)”概念。本研究主要探討中藥序貫式結腸透析對CKD大鼠腸道菌群的影響，進一步明確中藥序貫式結腸透析治療CKD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠40只，雄性，2個月齡，體質量(180±20)g，合格證號：SCXK-(軍)2007-004，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。在山西中醫藥大學實驗室飼養，保持室溫在 18～25 ℃、相對濕度為(50%～60%)，采用人工12 h 晝/夜循環照明環境中用全價營養、分籠飼養。每日按時清洗籠舍，保證大鼠能自由攝食及飲水。

1.2 儀器 試劑和藥物恒溫培養箱：(36±1)℃，美國Themo公司，型號Model 311；超凈工作臺：蘇州蘇凈有限公司，型號 SW-CJ-2FD；混勻儀：大龍興創實驗儀器(北京)有限公司，型號 MX-S；冰箱：中科美菱，型號 YCD-EL259A；天平：精度 0.01 g，梅特勒-托利多有限公司，型號ME1002；純水儀：Thermo 公司，MicroPure UV/UF；四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent1100，Agilent，日本)。

1.3 5/6腎切除腎纖維化大鼠模型的建立實驗時大鼠10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉后，俯臥位固定于鼠臺上。大鼠備皮，75%乙醇消毒。從距左肋骨下緣、脊柱旁開 l.5 cm處皮膚做一縱向切口，長約 1.5 cm，逐層分離筋膜、腹內外斜肌筋膜、進入后腹膜腔，分離脂肪層，暴露左側腎臟，鈍性分離脂肪囊，小心剝離腎包膜及腎上腺，注意避免損傷腎上腺，動脈夾夾閉左側腎蒂，切掉左腎上、下極2/3 腎實質，明膠海棉壓迫創面止血，去掉動脈夾觀察30～50 s后無繼續出血，小心將殘腎還納入腹腔，逐層縫合肌層、皮下及皮膚，局部消毒。1周后切去右腎，麻醉及手術過程相同，即制備成5/6腎切除大鼠模型。

1.4 分組給藥將40只SD雄性大鼠按Excel生成的隨機數字表法隨機分為正常組(10只)、模型組(10只)、中藥序貫式結腸透析組(10只)、陽性對照組(10只)。正常組大鼠正常條件飼養，不造模；其余各組大鼠制備成5/6腎切除大鼠模型。造模8周檢測大鼠Scr、BUN 水平，檢測造模情況。

正常組、模型組均予每天灌胃1次生理鹽水；陽性對照組給予鹽酸貝那普利5 mg/kg·d藥液灌胃，每天1次；中藥序貫式結腸透析組予以陽性對照組基礎治療上加中藥序貫式結腸透析。結腸透析液方藥為自擬腎衰腸療方:生大黃30 g，大黃炭15 g，煅龍骨30 g，煅牡蠣30 g，土茯苓30 g，蒲公英30 g，附片6 g，丹參15 g，五倍子10 g，芒硝10 g。每周3次，12次為一個療程。

藥物給藥共干預15 d，中藥序貫式結腸透析組在停止西藥后，繼續透析至療程結束，處死大鼠。腹主動脈采血后摘除左腎，回腸內容物、肝、腎、脾、淋巴結放入液氮保存以檢測相關指標。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般情況觀察小鼠進食、飲水量、精神狀況、皮毛變化及活動情況，每周測量小鼠體質量與24 h尿量、飲水量。

1.5.2 血液中代謝毒素水平相關指標檢查收集血液，檢測血清中血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)、內生肌酐清除率(Ccr)、尿肌酐(Ucr)水平。

1.5.3 IS與PCS檢測大鼠于受試前后空腹采取靜脈血，分離血清，-80 ℃低溫冰箱凍存待用，高效液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜(HPLC-ESI-MS/MS)法測定血清 PCS、IS。IS標準品(純度99.2%，Sigma-Aldrich公司，美國)，PCS標準品(純度 99.8%，Sigma-Aldrich公司，美國)。

2 結果

2.1 一般情況給藥結束后，與正常組比較，模型組大鼠精神狀態較差，體質量顯著降低(P<0.05)，24 h尿量、飲水量顯著增加(P<0.05)，出現多飲、多尿情況；與模型組比較，各治療組大鼠的精神狀況均有一定改善，陽性對照組和結腸透析組大鼠體質量顯著升高(P<0.05)、24 h飲水量、尿量顯著減少(P<0.05)；與陽性對照組相比，中藥序貫式結腸組大鼠24 h飲水量、尿量顯著減少(P<0.05)，提示中藥序貫式結腸透析可以改善CKD大鼠多尿癥狀。見表1。

表1 各組大鼠一般情況測定結果比較 (只，

2.2 代謝毒素水平變化與正常組比較，模型組大鼠24 h血清中SCr、BUN、UA水平均顯著升高(P<0.05)，Ucr、Ccr水平顯著降低，這與CKD患者后期代謝毒素水平變化相一致；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中SCr、BUN、UA水平均顯著降低(P<0.05)，Ucr、Ccr水平顯著增高(P<0.05)，這提示貝那普利與中藥序貫式結腸均可以下調CKD大鼠體內代謝毒素的水平；與陽性對照組相比，中藥序貫式結腸組大鼠血清中BUN、UA水平均顯著升高(P<0.05)，Ucr、Ccr水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠代謝毒素水平測定結果比較 (只，

2.3 血清中IS與PCS變化與正常組比較，模型組大鼠血清中PCS、IS 含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥序貫式結腸透析組大鼠血清中PCS、IS 含量均顯著降低(P<0.05)；與陽性對照組相比，結腸透析組大鼠血清中PCS、IS含量均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中IS與PCS測定結果比較

3 討論

中藥保留灌腸是由張仲景“蜜煎導法”逐漸完善和發展而來，對延緩腎衰進程具有顯著優勢，已有報道稱中藥灌腸可以對腸道菌群起到調節作用，羅學文[8]發現中藥腎衰方灌腸組大鼠的大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌均有改變; 鄒川等[9]發現予中藥大黃復方灌腸治療慢性腎衰2周后，患者糞便培養可見大腸桿菌菌落計數較治療前明顯減少，總厭氧菌菌落計數、雙歧桿菌、乳桿菌菌落計數較治療前均明顯增加。由于中藥序貫式結腸透析由中藥灌腸發展而來，其彌補了傳統中藥保留灌腸的不足，將中醫與現代技術相結合，仿腹膜透析原理，經彌散和滲透，清除血中毒素，有效保護殘余腎功能、延緩腎衰進程。

有研究顯示，中藥序貫式結腸透析技術中所選的中藥眾多，有大黃，當歸，黃芪、蒲公英、牡蠣等；生大黃、六月雪、槐角等[9-11]。本實驗選擇山西中醫藥大學附屬醫院腎病科科室多年臨床總結的有效經驗協定方劑腎衰灌腸方，來驗證該技術對腸道菌群的影響。

蛋白結合類毒素與尿毒癥患者多器官損害密切相關，其中IS、PCS是蛋白結合類毒素的典型代表。此類毒素在CKD患者體內的蓄積能加重腎臟病，并可導致多系統疾病，如神經系統疾病、心血管疾病、腎性骨病等，嚴重影響患者生存率及其生活質量[12]。據報道，在CKD 3～5期，血清IS、PCS 濃度與CKD呈明顯負相關，腎功能下降可導致以上毒素的明顯升高[13]。IS、PCS可通過激活RAS系統、誘導細胞因子、增強氧化應激等機制加速腎功能惡化[14]。PCS主要由腸道厭氧菌產生，將食物中的苯丙氨酸、酪氨酸轉變為4-羥基苯乙酸，再脫羧為對甲酚，大量對甲酚經由腸道黏膜吸收，在腸道上皮細胞經磺基轉移酶轉化為PCS。PCS主要通過腎小管基底膜側的有機陰離子轉運體轉運至腎小管管腔，經尿液排出。IS主要在腸道中產生，食物中的色氨酸經大腸桿菌分解產生吲哚，后者經門靜脈吸收入肝臟，再經過羥化、硫酸化而產生IS。血液中IS也是主要通過腎小管有機陰離子轉運體分泌、排泄[15]。由于 IS、PCS主要由腸道產生，理論上可以通過改變腸道菌群降低IS、PCS濃度。本研究發現中藥序貫式結腸透析可以降低血清IS、PCS 濃度，考慮與其延緩腎衰竭作用與增加IS、PCS分泌排泄有關,需要進一步研究。

近年來，對于中藥灌腸對腸道菌群的影響研究逐漸增多，鄒川等[9]研究發現經大黃復方制劑灌腸治療后，腸道菌群明顯改善，表現為大腸桿菌菌落計數明顯減少，雙歧桿菌、乳桿菌菌落計數明顯增加; 腸道屏障功能的改善，D-乳酸和內毒素水平明顯降低。姬衛國等[16]對慢性腸炎腸道菌群與中藥聯合抗生素灌腸療效研究顯示，中藥辨證施治聯合抗生素灌腸可顯著改善不同證型腸道菌群失調及大便常規指標，提高中醫證候療效，其機制可能與調節腸道菌群有關，本研究結果表明，應用中藥序貫式結腸透析技術能有效下調CKD大鼠的代謝毒素水平，尤其可減少腸源性尿毒素BUN、UA 的吸收或增加其排出，從而改善腎功能，延緩腎衰竭的進展。