氣相色譜-質譜聯用法測定香米中添加的5,6,7,8-四氫喹喔啉

鮑忠定，王東銘，王 瀟

(浙江公正檢驗中心有限公司，浙江 杭州 310030）

大米作為人們日常主食，因有其高產、穩產、適應性強、經濟價值高的優勢，在國民經濟中占有極其重要的地位。隨著居民的收入水平和健康意識的不斷提高，消費者對大米食味品質的要求逐漸提高，特別是對口感的要求已從“可以吃”向“是否好吃”轉變[1-3]。香米是一種具有特別香型和特殊風味的稻米，深受我國相當數量人口的喜愛，消費需求呈現日益增長的趨勢，其價格相對于普通非香米而言常常高出2～3倍[4-5]。

國內外學者從20世紀70年代開始對稻米香味化學組分進行了研究，研究表明香米特征化合物和主要香氣貢獻物為具有“爆玉米花”香韻的2-乙酰-1-吡咯啉[6-9]。受經濟利益驅動，一些不良商家通過在普通大米中添加香米香精以制作“人工香米”以牟取暴利；這種摻雜使假行為不僅損害了消費者的利益并可能造成一定的健康風險，還嚴重擾亂了市場的正常秩序。2009年 10月衛生部曾發布公告：根據《食品安全法》及其實施條例的規定，大米等糧食生產加工過程中使用香精香料缺乏工藝必要性，大米等糧食生產者不得在生產加工過程中使用香精香料；食品添加劑使用標準GB 2760—2014明確規定：大米中不得添加任何食品用香料、香精[10]。但仍有不法分子為欺騙顧客、擴大銷售、牟取暴利在普通大米中加入香米香精，假冒特定品牌的優質大米[11]。

目前對香米中是否添加了香精的分析研究主要有蓋崴等[12]利用紅外光譜法尋找丙二醇吸收峰定性鑒別是否添加了香精溶劑。馮永巍等[13]通過氣相色譜法檢測2-乙酰基吡啶對增香大米進行鑒定。孫明哲等[14]采用碘量法測定大米中的香精溶劑 1,2-丙二醇。各種方法均有缺點，2-乙酰基吡嗪、2-乙酰基吡啶和丙二醇只在部分香米香精中含有。前期研究表明在所購的香米香精樣品中都檢出5,6,7,8-四氫喹喔啉物質，有部分香米香精樣品含有2-乙酰基吡嗪或2-乙酰基吡啶。5,6,7,8-四氫喹喔啉天然微量存在于花生和榛子中，有堅果、烤香、谷物、豆香、小麥香氣以及堅果、爆玉米花味道[15]，具有與天然香米特征芳香物質類似的香氣。目前國內外還未有對香米中添加的5,6,7,8-四氫喹喔啉的鑒別、分析研究報道，針對大米中添加香米香精，以次充好、以舊充新、冒充品牌的現象，通過測定香米中添加的 5,6,7,8-四氫喹喔啉的含量鑒別香米的真偽，可有效打擊大米造假的不法行為，為大米中違法使用香精的監管提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售的5種不同品牌香米（分別以樣品A、B、C、D、E表示）；3種稻谷樣品樣品購于浙江、黑龍江、湖南主產地，品種為中浙優8號、龍稻18和農香32（分別以稻谷1、2、3表示）；5,6,7,8-四氫喹喔啉標準物質（純度＞98.0%）：日本東京化成工業株式會社；無水乙醇、乙醚（分析純）：永華化學股份有限公司（江蘇）；無水硫酸鈉（分析純）：江蘇強盛功能化學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GC 7890B-5977B氣相色譜質譜聯用儀：美國agilent公司；FY-SXT-06索氏抽提器：杭州菲躍儀器有限公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋、DGG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；DH5B離心機：湖南多恒儀器設備有限公司；R-210旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；JLG-II型實驗礱谷機：中儲糧成都糧食儲藏科學研究所；LYJM-2型碾米機：鄭州良源分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取按其純度折算為 100%質量的5,6,7,8-四氫喹喔啉標準品100 mg，用無水乙醇溶解，配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，于4 ℃棕色瓶中避光保存。根據檢測樣品中5,6,7,8-四氫喹喔啉的測定要求，用無水乙醇配制成 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0 mg/L的系列標準工作溶液，現用現配。

1.3.2 樣品前處理

稻谷樣品經過實驗礱谷機脫殼處理后，再通過實驗室用碾米機進行碾磨處理，得到香米試樣備用。將香米試樣置于105 ℃電熱干燥箱中干燥30 min，冷卻后，稱取10.0 g香米顆粒樣品，用濾紙包裹于索氏抽提器中，由抽提器冷凝管上端加入無水乙醚至接受瓶內容積的三分之二處，于45 ℃水浴上加熱，回流提取2.0 h。取下接收瓶，回流液過無水硫酸鈉柱干燥，于 45 ℃水浴中充氮保護旋轉濃縮至近干，氮氣吹干，用無水乙醇溶解、混合，并定容至2.00 mL。然后在4 000 r/min離心機離心分離5 min，取上清液過0.45 μm濾膜后供氣相色譜質譜儀檢測分析。

1.3.3 色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱為 HP-INNOWAX毛細管柱（30 m×0.25 mmi.d.×0.25 μm）；進樣口溫度為230 ℃；載氣為高純氦氣；流速為1.0 mL/min（恒流）；柱溫初始溫度 100 ℃，保持 2 min后，以10 ℃/min升至200 ℃，保持8 min；分流比15∶1；進樣量 1 μL。

質譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電離能量 70 eV；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；連接線溫度：280 ℃；溶劑延遲時間5.0 min；選擇離子采集（SIM）。

2 結果與分析

2.1 定性及定量離子的選擇

在選定的前處理條件及色譜-質譜條件下，對樣品進行測定。圖1、2分別為稻谷、香米試樣的GC-MS總離子色譜圖（TIC），由圖可知，稻谷試樣中不含峰 1，香米試樣中峰 1能與其它化合物獲得有效分離，無干擾峰；保留時間為10.13 min。圖 3為峰 1的質譜圖，經 NIST譜庫檢索，與5,6,7,8-四氫喹喔啉標準質譜圖匹配（二者之間相似度為90%）。經比較可確定峰1為5,6,7,8-四氫喹喔啉，質核比m/z為106、119、133和134的碎片離子峰是 5,6,7,8-四氫喹喔啉的主要特征離子。采用選擇離子監測模式對目標物進行定量時，通常選擇靈敏度高、抗干擾能力強的碎片離子為目標離子定量。因此選擇5,6,7,8-四氫喹喔啉的定量離子是 m/z 134，定性離子是 m/z 106、119、133。

圖1 稻谷樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatography of paddy

圖2 香米樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatography of the aromatic rice

圖3 峰1質譜圖Fig.3 The mass spectrum of peak 1

2.2 前處理條件的優化

5,6,7,8-四氫喹喔啉幾乎不溶于水，屬于非極性化合物，依據相似相溶原理應選擇非極性或弱極性溶劑作為提取劑，選擇無水乙醚、無水乙醇、正己烷提取溶劑進行了比較，圖4結果表明，選擇無水乙醚作為提取溶劑，回收率好，試樣基質的干擾少。

圖4 不同試樣制備和不同提取溶劑5,6,7,8-四氫喹喔啉回收率測定結果Fig.4 Effects of sample preparation and extraction solvent on recovery results of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline

比較選擇整粒米和粉碎米作為實驗對象，圖4結果表明采用整粒米和粉碎米的回收率均達到80%以上，由于粉碎米的米粒太小太輕，對樣品的包扎要求嚴格；此外試樣的緊密程度不一，使米粒之間的空隙大小不一，造成抽提速度和試樣的重復性測定結果有一定影響；而整粒米由于其表面天然的致密結構，噴霧的香米香精粘附在大米顆粒表面較難滲入內部，故選取整粒米作為實驗對象是可行的。

選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h等不同的提取時間，考察提取時間對香米中添加的5,6,7,8-四氫喹喔啉提取率的影響；圖5結果表明抽提時間控制在2.0 h，既能保證目標物的有效提取，又能減少試樣中脂溶性成分的提取。

圖5 不同提取時間5,6,7,8-四氫喹喔啉回收率測定結果Fig.5 Effects of the extraction time on recovery results of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline

2.3 線性關系、檢出限

取 5,6,7,8-四氫喹喔啉標準系列工作溶液（1.3.1）按照1.3.3所述的色譜和質譜條件進行分析，以目標物峰面積對應目標物濃度（mg/L）進行回歸分析，結果表明 5,6,7,8-四氫喹喔啉在0.5～10.0 mg/L濃度范圍內呈良好的線性關系，線性關系R為0.999 4；以3倍信噪比確定方法的檢出限為0.05 mg/L。

2.4 方法精密度、回收率

平行測定6份供試香米樣品，在上述分析條件下測定香米中5,6,7,8-四氫喹喔啉的含量，以考察方法的精密度。結果表明，6份供試樣品中5,6,7,8-四氫喹喔啉的含量分別為 0.269、0.283、0.294、0.271、0.297和0.266 mg/kg，相對標準偏差（RSD，n=6）為4.77%。以上述供試香米樣品和稻谷為代表基質，分別在3個水平下進行加標回收實驗，考察方法的準確度。其測定結果見表1所示，香米試樣和稻谷的加標回收率在81.00%～93.70%與 80.00%～92.80%之間，結果表明方法在低、中、高濃度5,6,7,8-四氫喹喔啉檢測上能保證相應的準確度，完全滿足日常分析檢測的要求。

表1 5,6,7,8-四氫喹喔啉回收率測試結果（n=6）Table 1 Recovery results of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline (n=6)

2.5 實際樣品測試

應用建立的方法對市售的稻谷和香米中5,6,7,8-四氫喹喔啉進行測定，測定結果見表 2。由表2結果可見，稻谷樣品不含有5,6,7,8-四氫喹喔啉；有1批次市售的香米中檢出5,6,7,8-四氫喹喔啉（0.12 mg/kg），樣品測試結果質譜圖和質譜確認圖如圖6、7所示，應是常規大米人為加入了香米香精，以冒充香米進行暴利銷售，結果表明該方法是一種有效鑒別香米真偽的方法。

表2 樣品中5,6,7,8-四氫喹喔啉的含量Table 2 The content of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxaline in the samples

圖6 樣品D中5,6,7,8-四氫喹喔啉的選擇離子監測質譜圖Fig.6 The selective ion monitoring mass spectrum of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxalinethe in sample D

圖7 5,6,7,8-四氫喹喔啉的定量和定性離子的質譜確認圖Fig.7 The conclusive diagram of quantitative and qualitative ion of 5,6,7,8-tetrahydroquinoxalinethe

3 結論

本研究建立了測定香米中添加的 5,6,7,8-四氫喹喔啉的氣相色譜-質譜檢測方法。香米試樣經索氏提取和凈化，根據保留時間和質譜定性，外標法定量。通過對方法回收率、精密度等方法學指標的研究，表明方法具有較高的回收率、精密度和靈敏度，適用于香米的快速定性測定及真偽鑒別，為大米中違法使用香精的監管提供科學參考和分析技術手段。