葡萄酵素發酵過程中的酵母菌篩選及品質變化分析

王印壯，丁玉峰，段定定，馬艷莉*，牟建樓*，劉亞瓊

1(河北農業大學 食品科技學院，河北 保定，071000)2(南陽理工學院，河南 南陽，473000)

根據QB/T 5323—2018《植物酵素》規定，食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供人類使用的酵素產品。其含多種功效酶[1]，多酚類物質[2]，有機酸、氨基酸以及維生素[3-4]等活性成分，使得食用植物酵素具有潤腸通便[1]，清除自由基、抗氧化[4]，解酒護肝[5]等生理功能。隨著公眾健康意識的增強，酵素產品倍受推崇。葡萄(VitisviniferaL.)為葡萄科葡萄屬落葉藤本植物，廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區[6]。由于其具有較高的食用、藥用及營養價值而受到公眾歡迎[7]，據2019年國家統計局數據，我國葡萄年產量達1 419.54萬 t。但其季節性較強，多汁皮薄含糖量高，采后貯藏期短、易腐爛變質，因此葡萄采后深加工對其提高附加值、拓寬市場極為重要，目前產品多以葡萄酒、葡萄干、葡萄果汁等為主。而以葡萄為原料開發新型酵素產品，不僅可以最大限度保留葡萄固有營養物質，還可增加新的活性成分，是集營養、保健、食療等功能于一身的產品，具有廣泛的市場前景[6]。蔣增良等[8-9]通過研究葡萄酵素自然發酵過程中抗氧化性能的變化及其與有機酸之間的關系，表明葡萄酵素在發酵過程中具有良好的抗氧化性與自由基清除能力，整體呈上升趨勢，并且發現其功能與有機酸、多酚以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等的協同作用有關。但自然發酵不易控制，易染雜菌且發酵時間長，因此安全可控的接種發酵技術可為實現工業化生產提供技術參考。

目前，研究表明食用植物酵素發酵過程中優勢微生物主要為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[3]。首先，基質中的各種微生物及酶類將多糖分解為單糖，葡萄糖在酵母菌作用下轉化為乙醇，同時，也可在醋酸菌的作用下轉化為葡萄糖酸，并且將乙醇轉化為乙酸，基質糖濃度下降，此過程伴隨著酶類的釋放，如蛋白酶、淀粉酶以及SOD等，因此酵母菌和醋酸菌在發酵過程中具有互利共生關系[10]。乳酸菌則能產生豐富的有機酸，改善酵素風味，同時作為有益菌還有維持人體腸道菌群平衡、提高免疫力、促進蛋白質和鎂元素吸收等作用[4]。LUCENA-PADRS等[11]利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術研究了西班牙綠橄欖發酵過程中的微生物變化，檢測出乳酸菌、馬內桿菌和丙酸桿菌，其中乳酸菌為整個發酵過程的優勢菌。王海英[12]利用16S和18S測序技術分析了番木瓜自然發酵過程中微生物組成，并從中篩選出2株優勢植物乳桿菌菌種以及2株優勢畢赤酵母菌種用于發酵番木瓜酵素，結果表明接種發酵的番木瓜酵素抗氧化能力高于自然發酵。

本研究通過探究不同酵母菌發酵葡萄過程中物質變化規律，篩選出適合葡萄發酵的酵母菌，然后將其與醋酸菌、乳酸菌進行依次接種發酵制備葡萄酵素，分析該過程中γ-氨基丁酸、有機酸、香氣成分等的變化規律，旨在明確接種發酵對葡萄酵素品質的影響，從而為葡萄酵素發酵條件的優化以及品質的提升提供理論基礎，為實現其產業化發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夏黑葡萄(SummerBlack)，河南南陽社旗縣；釀酒酵母 CL-13、JL-11、JL-24、XQ-05、發酵畢赤酵母 CL-03、庫德里畢赤酵母 CL-19、曼束里卡畢赤酵母 JL-25，河南省工業微生物菌種保藏中心；巴氏醋桿菌CGMCC 1.41、植物乳桿菌ACCC 11095，北京生物保藏中心。

MRS肉湯(BR)，北京奧博星生物技術公司；3,5-二硝基水楊酸(AR)，天津市光復精細化工研究所；草酸、酒石酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸(HPLC級)，美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚、對硝基苯酚(HPLC級)，上海科密歐公司。

1.2 培養基

YEPD培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸出粉10，121 ℃下滅菌20 min(固體培養基，再加入15 g/L瓊脂粉)。

許氏醋酸菌種子培養基(g/L)：葡萄糖5，酵母浸出粉5，121 ℃下滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無水乙醇。

1.3 儀器與設備

GC-7890氣相色譜儀、7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；CR-400色差計，日本柯尼卡美能達公司；UV-752 N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 發酵基質制備

挑選無機械傷、病害的新鮮葡萄，洗凈、晾干、打漿后倒入滅菌后的玻璃罐中，添加紅糖至糖度為18 °Bx，用75 mg/mL的果膠酶(酶活力500 U/mg)于50 ℃下酶解40 min。之后100 ℃滅菌15 min[6,13]，為避免轉移過程污染雜菌再置于超凈工作臺上紫外殺菌15 min，冷卻至室溫，得發酵基質。

1.4.2 酵母菌篩選

1.4.2.1 酵母菌液制備

活化：將甘油管中的7株酵母菌，分別取20 μL涂布于YEPD固體培養基上，培養2～3 d，挑取單菌落，接種于液體培養基中，37 ℃培養36 h，得酵母菌活化液，菌液濃度>106CFU/mL。

生長曲線測定：采用比濁法，將7種酵母菌活化液，分別以3%接種量接種于液體培養基中，置于28 ℃、150 r/min下搖床培養，并于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h測定其OD600值，以未接種活化液YEPD培養基為對照，繪制生長曲線[14]。

分別將7株酵母菌對數生長期末期的菌液進行收集，做接種用酵母菌液。

1.4.2.2 不同酵母菌發酵

將7種酵母菌液，分別以5%接種量接種于發酵基質中，常溫避光發酵6 d，每隔1 d取樣，分析不同酵母菌發酵特性與主要功效酶活性的動態變化。

1.4.3 葡萄酵素制備

將篩選出的酵母菌于對數生長期末期收集，制備酵母菌液；將前期試驗篩選出的醋桿菌、乳桿菌，按1.4.2.1中的方法培養至對數生長期末期(醋桿菌于30 ℃，180 r/min搖床培養48 h；乳桿菌于37 ℃、200 r/min 搖床培養22 h)收集，制備醋酸菌液、乳酸菌液。

將3%酵母菌液接入發酵基質中，發酵6 d，再接入5%醋酸菌液，發酵至第27天，過濾除菌，最后接入3%乳酸菌液，發酵至第41天。分別于第0、3、6、13、20、27、34、41天取樣。為避免雜菌污染所有操作均在超凈工作臺中進行。

1.4.4 發酵特性測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量[15]；參照陳玉香等[16]的方法測定乙醇含量；參照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》測定總酸含量；利用酸度計測定pH值。

1.4.5 主要功效酶活性測定

采用GB/T 5009.171—2003中鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性；參照侯曉瑞[17]的方法測定β-葡萄糖苷酶活性。

1.4.6 顏色評估

采用色差計和CIELab 顏色空間分析顏色變化[18]，其中L*描述從黑色到白色的亮度范圍，a*表示紅色到綠色、b*表示黃色到藍色的變化情況，色度(CI)為A420、A520和A620之和，色調(Hue)為A420/A520的比值。

1.4.7 有機酸含量測定

樣品前處理：將2.5 mL樣品與1 mL 10.6%的K4Fe(CN)6·3H2O溶液、1 mL 30.0%的ZnSO4溶液混合，用去離子水定容至50 mL，反應30 min后取上清液離心，然后經0.45 μm膜和C18柱過濾，待測[19]。

色譜檢測條件：色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，進樣量10 μL，流速0.9 mL/min，流動相0.02 mol/L NaH2PO4(用磷酸調pH至2.1)，柱溫30 ℃，二極管陣列檢測器，波長210 nm[20]。

1.4.8 γ-氨基丁酸含量測定

參照QB/T 4587—2013《γ-氨基丁酸》中的方法測定。

1.4.9 香氣成分測定

采用頂空固相微萃取法對香氣成分進行富集。將7.5 mL樣品、1 g NaCl和25 μL 300 μg/mL的3-辛醇置于20 mL頂空瓶中，40 ℃水浴平衡15 min后插入纖維頭吸附40 min，再放入GC進樣器中解析6 min。

檢測條件參照AUBERT等[21]氣相色譜-質譜聯用的方法稍作修改。色譜柱HP-INNOWax毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，烘箱升溫程序：50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min，注射器溫度240 ℃，載氣(氦氣)流量1.45 mL/min，分流比5∶1，離子源和質譜傳輸線溫度分別為240、250 ℃，電子能量70 eV，質量范圍33～550m/z。

1.5 數據處理

使用IBM SPSS Statistics 26對數據進行單因素方差分析(P<0.05)及LSD、Duncan多重比較分析，采用Origin 2019進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 酵母菌篩選

2.1.1 不同酵母菌生長曲線分析

酵母菌生長曲線一般分為4個時期，在制備酵素時，酵母菌最佳收集菌體接種時間為對數生長期末期，故通過測定7株酵母菌生長曲線，確定最佳收集菌體接種時間[22]。由圖1可知，JL-25、CL-03于20 h，JL-11、JL-24、XQ-05、CL-13于14 h，CL-19于16 h左右進入對數生長期末期。因此，確定20 h為JL-25、CL-03的收集接種時間，14 h為JL-11、JL-24、XQ-05、CL-13，16 h為CL-19的收集接種時間。

圖1 不同酵母菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of different yeasts

2.1.2 不同酵母菌發酵特性分析

糖類是酵母菌生長代謝的主要碳源，通過糖代謝可生成酒精等代謝產物，還原糖、乙醇含量的變化不僅能反映出微生物生長代謝情況，還可直接影響產品風味[23]。由圖2-a、圖2-b可知，不同酵母菌在發酵過程中還原糖含量逐漸下降，其中JL-11、JL-24、CL-13和XQ-05在發酵基質中適應能力強，發酵速度快，第2天時含量即趨于0，同時，酒精度也于第2天達到最大值，之后趨于穩定；JL-25、CL-3和CL-19適應能力弱，發酵時間較長，還原糖含量分別于第4、5、6天趨于0。不同酵母菌發酵結束時酒精含量在8.00%vol左右。總酸度和pH的變化可反映發酵過程是否正常。由圖2-c、圖2-d可知，不同酵母菌在發酵過程中總酸度總體呈升高趨勢，pH值則與之相反，其中釀酒酵母XQ-05相較于其他菌株產酸能力穩定，受基質酸度影響不大，表現出較強發酵產酸性能與基質適應能力，在發酵第6天時總酸含量顯著高于其他菌株(P<0.05)且pH最低為3.50。

2.1.3 不同酵母菌主要功效酶活性分析

由表1可知，7株酵母菌在發酵過程中，SOD活力呈先上升后下降再上升趨勢，下降的原因可能是由于酵母菌正處于快速生長時期，密度增高以及衰老時消耗次級代謝產物，使得SOD活力降低[24]，其中XQ-05 于第2天達到最大值58.06 U/mL，其余菌株均在第6天達到最大值，表明其產酶速度相較于其他菌株快。β-葡萄糖苷酶對酵素香氣成分的形成有重要作用[25]，由表2可知，不同酵母菌產β-葡萄糖苷酶的能力有顯著差異(P<0.05)，JL-11和JL-24僅在發酵第2天檢出，CL-19和CL-13在發酵過程中未檢出、CL-03和JL-25呈不穩定的波動趨勢，而XQ-05在發酵過程中β-葡萄糖苷酶活性穩步升高，并于第5天增至518.06 μU/mL。這可能是由于不同酵母菌合成、釋放β-葡萄糖苷酶的能力及所處發酵環境的影響所導致[17]。

a-還原糖；b-酒精度；c-總酸；d-pH值圖2 不同酵母菌發酵過程中還原糖、酒精度、總酸和pH值的變化Fig.2 Changes of reducing sugar, alcohol, total acid and pH of different yeasts during fermentation 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

表1 不同酵母菌發酵過程中SOD活力的變化 單位：U/mL

表2 不同酵母菌發酵過程中β-葡萄糖苷酶活力的變化 單位：μU/mL

綜上分析7株酵母菌發酵過程中物質變化規律可知，釀酒酵母XQ-05在葡萄基質中適應性強，發酵速度快，產酶能力較強且穩定，適合葡萄酵素快速發酵生產，可用于進一步研究。

2.2 葡萄酵素品質特性分析

將篩選出的釀酒酵母XQ-05與巴氏醋桿菌、植物乳桿菌依次接種發酵制備葡萄酵素。經測定，發酵結束后其各項基本理化指標，如還原糖含量0.46 g/L，酒精度(0.47±0.02)%vol，總酸含量(19.09±0.36)g/L，pH(3.19±0.03)等，均滿足QB/T 5323—2018《植物酵素》規定的要求。

2.2.1 葡萄酵素發酵過程中顏色的變化

顏色是葡萄酵素最直觀的感官特征，主要呈色物質為花色苷，其組成和含量對酵素色澤有顯著影響，花色苷不穩定在發酵中易受pH值、溫度和微生物等因素的影響，顏色特征能夠反映出酵素發酵工藝和原料的好壞，也是人們接受度的重要參考指標[26]。由表3可知，發酵過程中，a*值在0.40～2.15內波動，發酵結束時顏色偏紅；b*值在-4.29～2.34內變化；第41天時樣品亮度(L*)顯著的高于其他樣品(P<0.05)。ΔE表示總色差，反映葡萄酵素在發酵過程中與葡萄汁相比顏色的變化程度，發現第41天時樣品色差最大，其次是第20和27天的樣品，表明接種發酵改變了葡萄酵素的顏色，這可能是由于發酵過程中酚類物質的轉變和發酵基質酸堿度的變化所導致[27]。葡萄酵素發酵過程中CI和Hue呈先降低后升高的趨勢，與對照相比，發酵結束后色調升高，色度降低。

表3 葡萄酵素發酵過程中顏色的變化Table 3 Changes of color during fermentation of grape Jiaosu

2.2.2 葡萄酵素發酵過程中γ-氨基丁酸的變化

γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經遞質，具有改善腦功能、降血壓、促進生長激素分泌等功能，為新型功能食品因子[3]。由圖3可知，葡萄酵素發酵過程中γ-氨基丁酸含量呈逐漸上升趨勢，發酵前3 d即酵母菌發酵前期，γ-氨基丁酸含量增長速度較快，而后(3～20 d)逐漸減慢，這可能是由于前期酵母菌生長代謝旺盛，分泌的蛋白酶活性高，故合成γ-氨基丁酸的速率較快，隨著發酵進行，酵母菌發酵產生乙醇、醋酸菌發酵產生乙酸等代謝產物，使得發酵基質環境發生改變，導致其合成的關鍵酶谷氨酸脫羧酶活性下降，故增加速度減慢[28]。第27天后，隨著乳酸菌發酵的作用，γ-氨基丁酸含量持續增加，發酵結束時達到38.95 μg/mL，顯著高于其他發酵時間樣品(P<0.05)，符合QB/T 5323—2018中規定的γ-氨基丁酸含量≥0.03 mg/kg的要求。葡萄酵素在接種發酵過程中，γ-氨基丁酸主要在酵母菌發酵階段產生，因此，在后續優化葡萄酵素品質時，可對酵母菌發酵階段的參數進行調節，從而提高葡萄酵素γ-氨基丁酸含量。

圖3 葡萄酵素發酵過程γ-氨基丁酸的變化Fig.3 Changes of γ-aminobutyric acid content during fermentation of grape Jiaosu

2.2.3 葡萄酵素發酵過程中SOD活力的變化

食用植物酵素富含多種功效酶類，例如淀粉酶、蛋白酶和SOD等。其中SOD常被用來評價酵素酶活性的高低[1]。因此，分析葡萄酵素發酵過程中SOD活力的變化具有重要意義。如圖4所示，葡萄酵素發酵過程中SOD活力整體呈升高趨勢，分析其原因主要是由于發酵過程中基質環境的改變以及微生物不斷分泌相應的功效酶等因素，從而使得SOD活力逐漸升高[22]。發酵前20 d，SOD活力變化不顯著(P>0.05)，為22.89～45.00 U/L；第20～27天時，SOD活力顯著升高(P<0.05)；接種乳酸菌后，SOD活力持續升高，于第41天升至135.00 U/L。表明葡萄酵素在依次接種發酵過程中SOD活力主要在醋酸菌發酵后期以及乳酸菌發酵過程中大幅提高，因此，在優化葡萄酵素品質以及工業化生產中可針對性對發酵階段進行調節控制，從而生產出富含高活性功效酶的產品，提高附加值。發酵結束時，葡萄酵素SOD活力符合QB/T5323—2018 中≥15 U/L的要求。與葡萄漿汁相比，發酵結束時SOD活力增長6倍，表明在葡萄酵素發酵過程中產生了較多抗氧化酶系，有利于清除活性氧。

圖4 葡萄酵素發酵過程中SOD活力的變化Fig.4 Changes of SOD activity during fermentation of grape Jiaosu

2.2.4 葡萄酵素發酵過程中有機酸的變化

有機酸是酵素發酵過程中的代謝產物，可賦予酵素獨特風味，所形成的酸性環境對某些有害微生物有抑制作用，并且在發酵過程中其種類和數量也會發生變化[29]。因此，研究酵素發酵過程中有機酸的種類和含量，對其感官質量評價極為重要。由表4可知，在發酵前6 d未檢測到乙酸，而丙酮酸、檸檬酸和蘋果酸含量增多，表明這一時期酵母菌主要通過糖代謝積累代謝產物；接種醋酸菌后，醋酸菌利用乙醇生成乙酸，乙酸顯著增加(P<0.05)；第27天時未檢測出乳酸，乙酸含量顯著升高(P<0.05)，這可能是由于某些微生物具有降解乳酸轉化為乙酸的能力[9]；而接種乳酸菌后，乳酸和檸檬酸含量分別增至102.09 mg/L和67.70 mg/L，蘋果酸含量下降至0，這可能是由于乳酸菌通過三羧酸循環將蘋果酸轉化成檸檬酸、通過蘋果酸發酵途徑將蘋果酸轉化成乳酸所致[30]。

表4 葡萄酵素發酵過程中有機酸的變化Table 4 Changes of organic acid during fermentation of grape Jiaosu

2.2.5 葡萄酵素發酵過程中香氣成分的變化

葡萄酵素香氣成分與原料、菌種和發酵環境等多種因素有關，研究發酵過程中香氣成分的變化，對酵素品質評價具有重要意義。葡萄酵素發酵過程中香氣成分變化的相應結果見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211115.2144.004.html)。發酵過程中共檢出43種香氣成分，其中醇類化合物和酯類化合物占比較高，香氣成分的種類隨著發酵時間而變化。

醇類化合物來源于酵母菌等微生物分解糖、蛋白質及氨基酸等物質產生[13]，共檢出14種。其中苯乙醇主要是由酵母菌以L-苯丙氨酸為前體通過戊糖磷酸途徑或利用葡萄糖通過草莽酸途徑生成，具有玫瑰香、紫羅蘭香和茉莉花香等多種香味，于第3天顯示出最高的濃度，隨后降低，這可能是由于發酵后期醇類物質與脂肪酸酯化所致[31]。高級醇是酵母菌的次級代謝產物，包括異丁醇、正丁醇、異戊醇、1-戊醇、5-甲基-2-環己醇、2-庚醇，主要來自葡萄糖的合成代謝及相應氨基酸的分解代謝途徑。酯類化合物構成了葡萄酵素的獨特風味，共檢出13種，總體呈先升高后降低的趨勢，降低的原因可能是由于發酵后期pH降低，酯類物質發生水解所致[32]。其中乙酸乙酯是葡萄酵素中含量較高的成分，在發酵第13天檢測出最高質量濃度，為30.07 μg/mL，隨著發酵時間的延長濃度降低，該物質廣泛存在于蘋果、梨等水果中，是構成葡萄酵素令人愉悅的花果香氣的主體成分。脂肪酸是構成葡萄酵素風味的重要化合物，共檢出4種，分別是乙酸、丙酸、異丁酸和異戊酸。乙酸在發酵過程中呈先升高后降低的趨勢，并于第27天檢測出最高值47.49 μg/mL，可能是因為這一時期醋酸菌利用乙醇生成大量乙酸。

醛類化合物是構成葡萄酵素發酵前期成熟果味的化學成分之一，其感官閾值較低，共檢出4種，分別是乙醛、己醛、(2Z)-2-庚醛和反式-2-己烯醛，乙醛在發酵過程中呈先升高后降低的趨勢，己醛、(2Z)-2-庚醛和反式-2-己烯醛僅在葡萄汁中檢測得到，質量濃度為0.03～0.14 μg/mL。酮類化合物在葡萄酵素香氣成分中占比較少，共檢出3種。其中3-羥基-2-丁酮在發酵后期濃度較大，4-羥基-2-丁酮僅在第27天檢出，2,3-丁二酮在發酵第34天檢出，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮是醋酸發酵階段的代表性產物，并且研究指出該物質的生成與乳酸有關[33]。

3 結論

在分析7株酵母菌發酵特性及功效酶的動態變化中，發現釀酒酵母XQ-05消耗還原糖能力快，產酸能力強，發酵速度快，且表現出較強的產酶能力，因此該菌株能很好地適應葡萄基質，適合葡萄快速發酵。在依次接種發酵葡萄酵素過程中，相比葡萄漿汁而言，產品偏紅；發酵過程中γ-氨基丁酸含量和SOD活力逐漸升高，第41天時分別達到38.95 μg/mL和135.00 U/L；有機酸含量的變化與微生物之間有著密切關系，造成各微生物發酵階段有機酸差異的主要為蘋果酸、乙酸和乳酸；發酵過程中共檢出43種香氣成分，其中醇類化合物和酯類化合物占比較高。本研究明確了不同酵母菌發酵葡萄過程中物質變化規律以及接種發酵過程中對葡萄酵素品質變化的影響，從而為葡萄酵素發酵條件的優化以及品質的提升提供理論基礎。