基于牡蠣肽構建油包水型乳液體系及其穩定性研究

楊文，鄭惠娜,2,3,4*，任鼎鼎，李晉禎，曹文紅,2,3,4，林海生,2,3,4，秦小明,2,3,4，章超樺,2,3,4

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088)2(廣東海洋大學 深圳研究院，廣東 深圳，518108) 3(國家貝類加工技術研發分中心 (湛江)，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江，524088) 4(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心(大連工業大學)，遼寧 大連，116034)

牡蠣肉質鮮美，營養豐富，富含39.1%～53.1%(干基)的蛋白質[1]，同時還含有維生素D，維生素B12，煙酸，核黃素，硫胺素等多種營養素[2]，是一種營養價值很高的海洋蛋白資源。目前，牡蠣主要以鮮食為主，精深加工產品少，發展空間大。牡蠣肽是以牡蠣肉為原料，經酶解、精制而得的小分子低聚肽，大量研究表明，牡蠣肽具有抗癌活性[3]、抗皺紋恢復光老化[4]、抗氧化[5]等生物活性功能。

來源于海洋的牡蠣肽具有特殊的腥味，導致消費者直接攝入口服的可接受程度較低；并且流動性較好的牡蠣肽基料具有極強的吸濕性，這限制了牡蠣肽相關產品的開發與商品化利用。此外，肽類對胃腸道消化的高度敏感性嚴重影響其生物利用度[6]，生物活性肽的適用性會因其在口服過程中的低生物穩定性而受到限制，導致其在達到人體預期目標之前降解并喪失結構和功能[7]。因此，構建合適的遞送體系，保護牡蠣肽生物活性[8]，靶向運輸遞送以提高牡蠣肽的生物利用度，同時掩蔽海洋源物質特殊腥味，擴大其應用領域具有實際應用價值和意義。

乳液是通過將一種液體以細小液滴(通常約為0.1～10 μm)的形式分散到另一種不混溶的液體中而形成的熱力學不穩定[9]體系。乳液系統是用于封裝，保護，輸送食品活性成分以及藥物的最優選輸送系統[10]。近年來，穩定的油包水(water/oil，W/O)乳劑的配方因其在封裝和保護敏感的水溶性生物活性營養素和藥物(例如維生素和礦物質)方面的潛在優勢而受到了許多研究者的關注[11]。因此本研究選擇W/O乳液體系包封親水性的牡蠣肽，并探究乳液的理化性質及對抗不同環境條件變化的穩定性。研究結果可為改善牡蠣肽相關產品性能，擴大牡蠣肽的應用范圍，促進牡蠣肽乳劑類相關功能保健產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

牡蠣肽，北京盛美諾生物技術有限公司；非轉基因一級大豆油(酸值為0.06 mg KOH/g，過氧化物值為0.026 g/kg)，中糧佳悅(天津)有限公司；食品級聚甘油蓖麻醇酸酯，上海源葉生物科技有限公司；超純水由實驗室制備。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX-T18型高速剪切機，德國IKA公司；OLYMPUS-CX43型光學顯微鏡，日本奧林巴斯光學公司；JIDI-UP-Basic型超純水機，廣州吉迪儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；PEN3型電子鼻，德國AIRSENSE公司；NMI20-060H-I型核磁共振分析成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣肽基料的粉體學性質表征

1.3.1.1 休止角

根據文獻[12]提供的方法并稍加改動，將玻璃漏斗垂直固定于鐵架臺上，使漏斗下端距離水平桌面的高度(H)為2.0 cm。將牡蠣肽粉末緩慢地倒入漏斗中，粉末自然下落直至堆積的粉末圓錐體頂端剛好接觸到漏斗下端停止，讀取粉末圓錐體直徑2R(cm)，并按公式(1)計算休止角：

(1)

1.3.1.2 滑動角

根據文獻[12]提供的方法并稍加改動，將長為L=50 cm的玻璃板水平放置，將其一端固定。準確稱取6.00 g的牡蠣肽粉置于玻璃板的非固定端，緩慢抬升非固定端至粉體開始滑動，記錄此時玻璃板非固定端抬升高度(H)cm，并按式(2)計算滑動角：

(2)

1.3.1.3 堆積密度與振實密度

堆積密度的測定[13]：取已稱重的10 mL量筒，質量記為m，用漏斗將適量牡蠣肽粉勻速注入量筒中，精密稱定質量，記為M，同時記錄粉末體積V1，堆積密度ρ1根據公式(3)計算：

(3)

振實密度的測定[14]：將上述裝有牡蠣肽粉的量筒從距離水平桌面大概2 cm處自由下落，重復25次，記錄粉末體積V2，根據公式(4)計算振實密度ρ2:

(4)

1.3.1.4 吸濕率

根據文獻[14]的方法，配制氯化鈉過飽和溶液(相對濕度75%)于干燥器中，室溫條件下飽和24 h。稱取3份牡蠣肽基料(1.456 7±0.582 6) g平鋪在稱量瓶中恒重48 h，然后轉移到過飽和氯化鈉溶液的干燥器中，12 d連續取樣稱重，根據公式(5)計算吸濕率:

(5)

1.3.2 W/O乳液的制備

采用超純水將牡蠣肽配制成質量濃度為200 g/L的溶液作為水相，以含5%(質量分數)聚甘油蓖麻醇酸酯的大豆油為油相。將水相緩慢加入到油相中以12 000 r/min的速度剪切分散3 min制備得到W/O型乳液。

1.3.3 乳液相關指標測定

1.3.3.1 乳化指數的測定

乳液的穩定性可通過乳化層的高度隨時間的變化來定量[15]，通過乳化指數反應乳液穩定性，乳化指數計算如公式(6)所示：

(6)

式中：He為乳液乳化層的高度，mm；H為油水相混合液的總高度，mm。

1.3.3.2 乳液顯微鏡觀察

新鮮制備的乳液樣品取5 μL均勻涂于載玻片上，用蓋玻片輕緩覆蓋，以最大程度地減少乳液被破壞[16]。顯微鏡在100倍香柏油浸沒的明場模式條件下對乳液外觀形態進行觀察并使用軟件CapStudio配套的相機定標拍照，獲得液滴的形態照片[17]。

1.3.3.3 乳液液滴尺寸大小及分布

根據參考文獻[18]提供的方法，選乳液的顯微形態照片，隨機選擇3個視野圖像，每個圖像用CapStudio Bioiogy 3.2.16軟件計數不少于100個液滴來分析乳液的平均粒徑和液滴粒徑分布。

1.3.4 電子鼻分析乳液掩蔽牡蠣肽氣味效果

取10 mL新鮮乳液樣品于50 mL頂空瓶中，立即加蓋密封，在室溫下靜置平衡30 min后測樣[19]。電子鼻進樣針連接的活性炭過濾器經烘干冷卻后進行測樣，活性炭過濾的空氣作為載氣清洗傳感器陣列[20]，沖洗時間為120 s，進樣流量為300 mL/min，載氣流速為300 mL/min；樣品測樣時間為60 s，取10個氣味傳感器響應值穩定后的數據做雷達圖分析乳液對牡蠣肽氣味包封效果。

1.3.5 乳液黏度

取新鮮乳液2 mL，采用35 mm不銹鋼平行板及配套的P35探頭，間隙為1 mm，在25 ℃條件下，剪切速率范圍為10～500 1/s，選擇連續剪切模式測定新鮮乳液的表觀黏度。

1.3.6 低場核磁成像

用標準樣品放入磁體箱內進行參數校正設置，然后將盛有2 mL乳液樣品的塑料皿置于成像線圈樣品臺中心，成像軟件選用NiuSE序列自旋回波成像。

1.3.7 乳液穩定性分析

1.3.7.1 不同貯藏溫度條件下乳液穩定性分析

選取最佳工藝參數制備新鮮乳液，將制備的乳液轉移到透明玻璃瓶中，分別在4、25、35 ℃條件下靜置貯藏15 d，每天測定乳液的乳化指數，拍照記錄宏觀相行為，觀察乳液液滴顯微形態并測量粒徑，分析貯藏環境溫度對乳液的影響。

1.3.7.2 乳液離心穩定性

新鮮乳液在室溫條件下4 000 r/min離心30 min以及8 000 r/min離心30 min，根據離心保留率評價乳液樣品的離心穩定性。離心保留率根據公式(7)計算：

(7)

1.3.7.3 乳液熱穩定性

制備新鮮乳后，立即對乳液進行水浴加熱處理[21]，選擇的加熱條件包括高溫短時處理(90 ℃、3 min)、低溫長時處理(70 ℃、30 min)和極端熱處理工藝(90 ℃、45 min)，然后立即用流動的自來水快速冷卻加熱的乳液[22]，觀察乳液表觀相行為測定乳化指數。

1.3.7.4 乳液循環凍融穩定性

將制備的新鮮乳液轉移到50 mL帶蓋樣品瓶中，在-18 ℃冷凍貯存24 h后，在室溫條件解凍1 h，觀察乳液表觀相行為變化，循環凍融操作3次[23]，觀察乳液表觀相行為測定乳化指數。

1.4 數據統計分析

實驗數據結果以平均值±標準差表示，使用Orgin 9.1做圖。使用SPSS 26.0進行統計分析，用單因素方差分析，采用Duncan法測定各變量平均值之間的顯著性差異，顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 牡蠣肽基料性質測定結果

牡蠣肽基料體外觀及顯微觀察如圖1-a所示，外觀均勻無雜質呈黃褐色粉末狀。休止角也稱安息角或自然坡度角，是粉體自然堆積斜面與底部水平面所夾銳角[24]；休止角表示物料顆粒之間的集聚或團聚能力；滑動角表示物料顆粒在接觸面上的附著能力[12]。其大小直接反映粉體的流動性，休止角越小流動性越好[24]。對于食品粉體，通常認為休止角小于30 °時流動性好[12]。牡蠣肽粉的休止角為(22.29±0.49)°，滑動角為(29.19±0.46)°，表明牡蠣肽粉具有極佳的流動性。堆積密度與粉體粒徑大小、微觀結構有關，堆積密度越小，表示粉體越疏松[25]，牡蠣肽基料的堆積密度為(0.469 7±0.007 6) g/mL，振實密度為(0.585 7±0.006 9) g/mL，表明牡蠣肽基較疏松，這有利用與其他原料混合復配。雖然牡蠣肽具有較好的流動性，但是其吸濕能力也較強(圖1-b)，嚴重限制了其在食品商業化生產中的應用。

a-牡蠣肽基料的直觀圖及顯微觀察圖； b-牡蠣肽粉吸濕率變化曲線圖1 牡蠣肽粉顯微觀察圖和吸濕曲線Fig.1 Microscopic observation and moisture absorption curve of oyster peptide powder

對牡蠣肽粉的吸濕率曲線進行二項式回歸擬合，得吸濕方程為：y=-0.002 2d2+0.044 3d+0.155 9，其中R2為0.947 2，表明擬合性較好。對吸濕方程一階求導，得吸濕速率方程為v=-0.004 4d+0.044 3，當吸濕速率為0時，說明牡蠣肽粉吸濕達平衡狀態，計算可知平衡時吸濕率為37.89%，這與12 d連續測定結果接近。與其他肽類的吸濕性結果相比，牡蠣肽平衡時吸濕率均高于文獻中[26]的不同動物來源(豬皮、牛皮、驢皮、鱈魚皮、牛骨)膠原肽的吸濕性，這樣的結果推測與肽的來源、種類及肽段氨基酸序列中不同的親水基團有關。

2.2 W/O乳液部分理化性質表征分析

2.2.1 乳液黏度及核磁成像結果

由圖2-a可知，乳液黏度隨剪切速率的增加而逐漸降低，到一定剪切速率后黏度趨于平緩，表明乳液在外力剪切時，分子結構被破壞，分子間結合力變差，黏度降低[27]，呈現剪切稀化現象，表明該乳液是假塑性流體。

在偽彩色圖像中，水分含量較高的區域顯示為紅色，否則顯示為藍色[28]。如圖2-b所示，圖像顯示均勻的藍色，說明油相作為連續相較好地覆蓋了分散水相，同時藍色在形成的圖像上均勻分布表明乳液分布，證實了油相對含有牡蠣肽水相的良好包裹。YANG等[29]通過低場核磁(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)成像測量了雙乳狀液的質子密度，通過這種簡單且無損的方法進一步解釋乳液中水分布與穩定性之間的關系。基于低場核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)的快速無損表征方法，被認為是最有吸引力的非侵入性技術之一，適用于追蹤食品原料中的物理化學變化[28]，也是不透明樣品(乳液)分析的理想選擇，提供了有利的方法表征樣品相關特性[30]。

a-乳液剪切黏度變化特性曲線；b-乳液核磁成像圖圖2 乳液流變及核磁成像結果圖Fig.2 Emulsion rheological and NMR imaging results

2.2.2 乳液掩蔽牡蠣肽腥味效果

PEN3型電子鼻傳感器陣列及其主要特性見表1。

表1 電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of electronic nose sensor

海洋產品的牡蠣肽具有不愉悅腥味，嚴重限制了消費者對牡蠣肽等一系列海洋產品的接受程度。電子鼻感官分析的結果可以提高感官評價的判別效率和準確性，是一種方便有效的氣味評價感官方法[31]。表1和圖3結果表明，W1W表示的無機硫化物是牡蠣肽腥味物質的主要來源[32]，乳液與牡蠣肽溶液的電子鼻分析結果對比顯示，乳液對牡蠣肽的不愉快腥味具有明顯的掩蔽效果。因此，通過乳化技術制備乳液體系掩蔽不良腥味來實現改善牡蠣肽相關產品的利用性能具有可行性。

圖3 乳液對牡蠣肽腥味掩蔽效果雷達圖Fig.3 Effect of emulsion masking oyster peptide fishy smell

2.3 不同貯藏溫度條件下乳液的穩定性

為模擬乳液產品在不同季節環境中的貯存情況，將最佳條件下制備的乳液置于不同溫度環境中恒溫貯藏，直觀效果如圖4所示。新鮮乳液平均粒徑為(0.64±0.05) μm，4 ℃貯藏15 d后平均粒徑為(0.71±0.06) μm，25 ℃貯藏15 d后平均粒徑為(0.82±0.11) μm，35 ℃貯藏15 d后平均粒徑為(0.88±0.13) μm，在35 ℃貯藏15 d后平均粒徑顯著高于25 ℃和4 ℃組。圖5結果表明，在35 ℃環境中貯藏的乳液會出現絮凝結塊現象，不利于乳液的貯藏。這與茅娟芝等[33]的高溫條件不利于乳液穩定結果一致。

a-乳液在不同溫度貯藏15 d的直觀效果圖； b-新鮮乳液在不同溫度環境貯藏15 d前后的顯微圖圖4 乳液在不同溫度條件下貯藏15 d直觀效果和顯微結構圖Fig.4 Visual effect and microstructure diagram of emulsion stored for 15 days under different temperature

圖5 乳液在不同溫度條件貯藏粒徑分布及變化Fig.5 Size distribution and variation of emulsion storage at different temperatures conditions

圖4和圖5表明，較高的貯藏溫度條件下導致液滴與液滴之間的碰撞頻率增加，這會導致液滴之間在沒有強烈排斥力的條件下促進聚集[34]，也是35 ℃條件出現大液滴，平均液滴粒徑較大的原因。乳液在4 ℃環境下貯藏時不結晶，仍具有較好的流動性。與同類型乳液產品比較，朱加進等[35]制備的W/O乳液常溫條件下保藏穩定，也不適合高溫貯藏。因此，乳液在4 ℃低溫和室溫25 ℃條件下均有較好的貯藏穩定性。

2.4 乳液離心穩定性結果

乳液在4 000 r/min離心30 min時無相分離現象，乳化指數和離心保留率均為100%。此時乳液無任何相分離現象，圖6所示。因為連續油相的高黏度阻礙液滴相對運動，使得乳液液滴相互碰撞接觸的程度減少，也證明油相對分散相的良好包裹效果，因此表現出極佳的穩定性。進一步提高轉速在8 000 r/min 離心30 min時，隨著離心力強度的增加，僅有少量油相上浮，無水相析出，乳化指數為(92.11±0.19)%，離心保留率為(91.66±0.62)%。朱加進等[35]制備的南極磷蝦油W/O型微乳液在3 000 r/min離心30 min后依然不分層，說明微乳的穩定性良好。試驗結果與同類型乳液相比，經歷高轉速二次離心時仍然具有一定的穩定性。因此，乳液對抗離心作用時具有極好的穩定性。

圖6 乳液在不同離心條件下的直觀效果圖Fig.6 Visual effect diagram of emulsion under different centrifugal conditions

2.5 乳液熱穩定性結果

加熱是食品常見加工方法，主要用于確保食品的微生物安全，加熱條件是模擬制造商對相似類型產品應用的處理條件進行[36]。加熱會引起吸附到液滴表面乳化劑分子的構象變化，從而改變其穩定液滴抵抗聚集的能力[34]，同時加劇了液滴運動碰撞進一步導致不穩定。圖7結果表明，在70 ℃加熱30 min和90 ℃加熱3 min條件下不會對樣品的穩定性產生明顯影響，說明該乳液體系對抗常規熱巴氏滅菌處理具有良好的穩定性。在極端熱處理90 ℃加熱45 min后有少部分水相析出，乳液分層，其乳化指數為(82.6±1.3)%，表明乳液對抗加熱應力具有穩定性。

a-乳化指數；b-直觀效果圖7 乳液不同熱處理的乳化指數及直觀效果Fig.7 Emulsification index and visual effects of different heat treatments of emulsion

2.6 乳液反復凍融結果

冷凍是保持食品營養和感官特性、抑制化學和微生物引起的腐敗以及延長食品貨架期的有效方式[37]。乳狀液在冷凍、貯藏及解凍過程中，穩定性受多種因素的影響，極易出現不穩定現象，造成食品感官、營養價值下降或縮短食品貨架期等[37]。如圖8所示，乳液經3次反復凍融后，仍具極好的穩定性，無任何相分離現象，乳化指數均為100%，說明該乳液對抗反復凍融體現出極好的穩定性。鐘明明等[23]制備的乳液產品經過1次凍融循環部分乳液能保持相對較好的穩定性，而經過2次凍融循環后乳液會出現不同程度的分層現象，這可能與制備乳液的類型及使用的乳化劑有關。

圖8 乳液經過3次凍融的直觀效果Fig.8 The visual effect of the emulsion after three freeze-thaw cycles

3 結論與討論

具有多種活性功能的牡蠣肽基料具有較好的流動性，但是極強的吸濕能力限制了其在食品工業化生產中的應用，同時由于特殊的海洋來源方式使其具有不愉悅的腥味，嚴重限制了消費者對牡蠣肽相關產品的接受程度。剪切乳化技術制備的牡蠣肽W/O型乳液，可以明顯掩蔽不愉快腥味，為相關產品的開發提供了除腥新思路。同時乳液在對抗不同環境應力時均表現出良好的穩定性，表明其在乳劑相關產品的開發利用具有一定潛力。綜上，試驗結果將為牡蠣肽在乳劑類功能保健食品行業中的更廣泛應用提供可能性，為牡蠣肽的穩態化遞送體系開發設計提供參考。