兩種電泳法分析丁香提取物對豬肌原纖維蛋白氧化位點的控制

陳洪生，馬金明，潘德胤，楊裕如，韓 齊，刁靜靜

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省中加合作食品研究發展中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

在肉類加工中，香辛料通常被加入到產品中以抑制脂肪和蛋白的氧化。近年來，在肉類加工中添加丁香提取物（clove extract，CE）改善肉制品品質已有部分研究。Zhang Huiyun等研究發現，CE可通過抑制脂質過氧化和清除自由基抑制廣式香腸中脂質氧化產物含量的增加和蛋白質羰基的生成。Armenteros等研究發現，在冷藏過程中CE可以抑制熟火腿中蛋白質發生氧化。前期研究發現，CE具有較好的抑制豬肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）氧化的作用。

電泳法在肌肉蛋白質的研究中早已得到了廣泛應用，雙向電泳法也已成為肉品科學領域的主要研究方法之一。在宰后肌肉代謝方面，Lametsch等最早應用蛋白質組分析了宰后豬肌肉的變化情況，其中15 個蛋白質點在宰后發生了顯著的變化。Zhou Changyu等研究金華火腿蛋白質組學特征及感官特性發現肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白是影響金華火腿口味中最重要的標記蛋白。在肉品貯藏加工方面，Zhang Muhan等對鵝肌肉保水能力相關蛋白進行了蛋白組分析，鑒定出21 個差異蛋白，包括結構蛋白、代謝酶、抗氧化酶與應激反應蛋白質。

本課題組前期研究表明CE可以顯著降低豬肉餅的脂質氧化和蛋白氧化水平；CE能夠有效抑制羥自由基氧化誘導的MP結構和功能性變化，且氧化3 h時，CE對各項指標控制明顯。在此基礎上，本實驗擬采用胰凝乳蛋白酶將氧化后的MP水解為肌球蛋白的頭部（S1）和尾部（Rod），進一步確定CE抑制蛋白氧化的具體部位，并結合雙向電泳法分析氧化3 h以及CE的添加對差異蛋白的影響，確定羥自由基氧化影響的主要氨基酸部位。蛋白質功能性的提高能夠通過抑制或控制蛋白氧化實現，這種方法在肉制品加工貯藏中具有重要意義，也為MP與CE的互作機理研究提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌和丁香香辛料購于黑龍江大慶新瑪特超市。

丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、,’-甲叉雙丙烯酰胺、牛血清白蛋白、Tris堿、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、1,4-哌嗪二乙磺酸（1,4-piperazine diethanesulfonic acid，PIPES）、乙腈 美國Sigma-Aldrich公司；-巰基乙醇 美國Amersco試劑公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）標準蛋白 寶生物工程（大連）有限公司；三氯乙酸、溴酚藍 天津化學試劑一廠。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DELTA320 pH計 美國Mettler Toledo公司；AL104精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；等電聚焦電泳儀 美國Amersham公司；5800 MALDI-TOF質譜儀 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 豬肌肉蛋白質提取

豬背最長肌垂直于肌纖維方向切成80～120 g的肉片，根據Park等方法提取MP并稍作修改，提取液和洗液需要冷卻至4 ℃使用最佳，MP的提取在4 ℃環境下完成。

1.3.2 蛋白含量測定

根據Chan等的雙縮脲法測定蛋白質含量，標準曲線方程：=5 192＋0.015 1，=0.999。

1.3.3 CE制備

根據Sun Qinxiu等的方法醇提CE，并稍作修改。將丁香置于40 ℃烘箱中干燥4.5 h并研碎成粉末，取5 g加入50 mL乙醇在超聲波細胞粉碎機中提取7 h，過濾。濾渣再用同樣方法提取12 h。濾液2 500 r/min離心15 min，取上清液進行蒸發濃縮，冷卻待用。

1.3.4 MP氧化

采用丁安子等的方法稍作修改。以10 μmol/L FeCl、100 μmol/L的抗壞血酸、10 mmol/L HO作為豬MP的氧化體系。用含0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液（pH 6.25）將提取的MP質量濃度稀釋為20 mg/mL。在前期實驗的基礎上，選擇CE質量濃度為1.0 mg/mL，使用氧化體系于4 ℃分別氧化0、1、3、5 h。最后通過添加1 mmol/L的水溶性VE（Trolox）終止氧化反應。未加氧化劑但含有Trolox的蛋白溶液作為對照。

1.3.5 MP水解

經氧化和CE處理后的MP用含0.1 mol/L NaCl和1 mmol/L乙二胺四乙酸的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5、20 mmol/L）稀釋成質量濃度4 mg/mL，加入胰凝乳蛋白酶（酶∶底物=1∶500）于25 ℃水解60 min，然后用0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟終止反應。

1.3.6 一維電泳實驗

采用SDS-PAGE對未氧化、氧化和添加CE后再氧化的MP進行分析，具體過程依據Chen Hongsheng等方法進行，按照表1配制分離膠和濃縮膠。電泳凝膠板為1 mm；上樣量為12 μL；開始電泳時電壓為80 V，待樣品進入分離膠后電壓為120 V；取出膠片用考馬斯亮藍染色0.5 h（染色液包括50%甲醇、6.8%冰醋酸和1 mg/mL考馬斯亮藍），用甲醇-冰醋酸脫色液洗脫至透明（脫色液組成包括5%甲醇和7.5%冰醋酸）。最后將電泳膠片置于天能凝膠成像儀攝像。

表1 分離膠和濃縮膠的組成Table 1 Composition of separating and stacking gels used for SDS-PAGE

1.3.7 雙向凝膠電泳實驗

雙向電泳選用1.3.1節和1.3.4節中制得的蛋白樣品進行，分別為未氧化的MP、氧化3 h的MP和加CE后氧化3 h的MP三個樣品做雙向電泳研究。用SDS-PAGE對氧化和未氧化的MP進行分析，具體過程依據G?rg等的方法稍作修改。將上述得到的3 個樣品離心，去上清液，重復2 次。加入400 μL的2D電泳細胞裂解液，功率100 W條件下冰浴超聲破碎10 s（間歇15 s，共10 次），13 400 r/min離心5 min后分裝，－80 ℃保存。各組樣品進行等電聚焦電泳。根據蛋白濃度檢測結果的計算，將一定含量的蛋白樣品與一定量的水化上樣緩沖液充分混勻，使上樣總溶液體積達到200 μL，上樣量80 μg；電泳條件為13 cm、pH 3～10的非線性膠條；等電聚焦條件和程序為30 V、12 h，500 V、1 h，1 000 V、1 h，8 000 V、8 h，500 V、4 h；將聚焦好的膠條放入平衡管中，加入平衡緩沖液緩慢搖動13 min；在進行第二向電泳前將冷凝水開啟，溫度達到15 ℃時，安裝垂直電泳儀；SDS-PAGE為12.5%的膠（15 mA膠30 min，再30 mA膠至溴酚藍離膠下沿0.5 cm停止電泳）。

1.3.8 雙向電泳凝膠的圖像分析

為了將雙向電泳凝膠中的蛋白質點實現可視化，本實驗參照Yan等方法，用UMax Powerlook 2110XL對銀染膠進行掃描，并采用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件對雙向電泳圖譜進行分析。3 個樣品各3 個重復，共9 塊膠。差異蛋白點檢測設置：兩組間同一蛋白點的相對豐度之比大于1.5 倍（檢驗，＜0.05），判定該點為差異表達蛋白點，當一組膠中某個蛋白點豐度高于另一組的1.5 倍時記為上調，反之記為下調。

1.3.9 雙向電泳凝膠切點胰蛋白酶消化和脫鹽

將標記的蛋白點切下呈粒狀，然后將膠粒切碎后轉入離心管中，加入200～400 μL含100 mmol/L NHHCO和30%丙烯腈（acrylonitrile，ACN）的脫色液（銀染時：加入30～50 μL的30 mmol/L KFe(CN)-100 mmol/L NaSO（1∶1，/）的脫色液），清洗脫色至透明，吸棄上清液，加入100 mmol/L NHHCO，室溫孵育15 min。吸棄上清液并凍干，加入5 μL質量濃度為2.5～10 ng/μL測序級胰蛋白酶溶液（酶與被分析蛋白的質量比一般為1∶20～1∶100），37 ℃條件下反應過夜（20 h左右）。吸出酶解液，轉移至新離心管中；在原管中加入100 μL含0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的60% ACN，超聲15 min，吸出并合并酶解液，凍干；若有較多鹽分，則用微孔膜進行脫鹽。

1.3.10 串聯飛行時間質譜鑒定蛋白點

取2 μL 20%乙腈溶液復溶凍干后的酶解樣品。取1 μL溶解樣品，直接點于樣品靶上。待溶劑自然干燥后，取0.5 μL過飽和-氰基-4-羥基肉桂酸基質溶液（溶劑為含0.1% TFA的50% ACN），點至對應靶位上并自然干燥。樣品靶經氮氣吹凈后放入儀器進靶槽，并用5800型串聯飛行時間質譜儀進行測試分析，激光波長為355 nm，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，一級質譜掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜分析，每個樣品點上選擇8 個母離子，二級質譜累計疊加2 500 次，碰撞能量為2 kV。質譜測試原始文件用Mascot 2.2軟件檢索相應的數據庫，最后得到鑒定的蛋白質結果。

1.4 數據處理

所有實驗至少重復3 次，利用Tanon軟件分析凝膠圖像、UMax Powerlook 2110XL軟件掃描銀染膠、Sigmaplot 12.5軟件作圖、ImageMaster 2D軟件分析二維電泳、PDQuest軟件分析二維電泳之間的差別。

2 結果與分析

2.1 CE對不同氧化時間MP的SDS-PAGE及影響部位

如圖1所示，兩塊膠中的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）含量均隨氧化時間的延長而逐漸減少并消失；但氧化1 h后，兩塊膠中未添加CE組的MHC條帶迅速消失，而添加CE組還有一定的MHC存在，這個結果與Chen Hongsheng等的結果一致。同時，兩塊膠中的Rod和S1含量均隨氧化時間的延長而逐漸減少；未添加CE組氧化5 h后，Rod和S1均全部消失，說明長時間的氧化使蛋白質結構充分展開（或肽鏈斷開），水解后形成大量的碎片，這些碎片表現為凝膠底部出現明顯條帶，說明氧化會使大分子蛋白減少，形成小的碎片。然而，添加CE組中，隨氧化程度的增加Rod也逐漸減少，但氧化5 h后并未完全消失；S1雖然也有一定程度的減少，但條帶依然很濃，說明CE對S1部位的保護作用更加明顯；由于Ca-ATPase存在于S1部位，前期研究表明CE控制了Ca-ATPase的氧化失活。盡管CE對Rod也有一定的保護作用，但與S1部位相比較，作用并不明顯，說明CE主要保護了S1部位的氧化損失。有趣的是，不管是否添加-巰基乙醇，未添加CE樣品的S1條帶都隨氧化時間的延長，而逐漸變淡；而肌動蛋白條帶隨氧化時間的延長，逐漸變濃。這說明氧化使S1分解成部分小的碎片，并且這些碎片與肌動蛋白發生交聯，形成了較大的分子聚集體，氧化5 h后S1徹底分解為碎片而消失，而此時肌動蛋白條帶也達到最粗（濃），并且下方又生成了幾個明顯的條帶；說明Rod和S1分解成小的片段后，一部分與肌動蛋白結合形成了大的聚集體，另一部分沒有與肌動蛋白結合的片段，在凝膠底部形成了較明顯的條帶。

然而，CE的添加徹底地改變了這種氧化修飾模式。由圖1可知，隨氧化時間的延長，S1并沒有顯著減少，同時肌動蛋白也沒有顯著變粗。添加-巰基乙醇后，肌動蛋白下方出現了一個明顯的條帶，同時肌動蛋白條帶顯著變淡，這說明Rod和S1分解生成的小片段主要是通過二硫鍵與肌動蛋白發生的交聯。

圖1 MP氧化和CE處理后經胰凝乳蛋白酶水解為S1和Rod的SDS-PAGE模式Fig.1 SDS-PAGE patterns of S1 and Rod after MP oxidation and CE treatment by chymotrypsin hydrolysis

Ooizumi等研究雞肉的肌球蛋白氧化時，發現隨氧化程度的增加，S1顯著減少。Xiong等發現豬肌球蛋白隨氧化程度的增加，Rod和S1損失明顯，當HO濃度超過5 mmol/L時Rod和S1基本消失，同時在它們的上方產生了一個新的條帶。這些結果與本研究結果基本一致。因此，CE的添加在一定程度控制了Rod的氧化損失，更大程度保護了長時間氧化下S1部位的裂解。

2.2 未氧化MP與氧化蛋白的雙向電泳圖譜及差異蛋白分析

掃描圖2中兩組雙向電泳圖譜后，得到了未氧化豬MP點1 453 個，氧化后得到蛋白點1 412 個。兩組樣品對比發現27 個差異蛋白點，做柱形圖進行豐度對比分析。如圖3可知，經羥自由基氧化后，差異點1815、1060、1968、1846和1049等10 個蛋白點的豐度顯著下降，蛋白點1060氧化后幾乎消失，說明這些蛋白對氧化應激的敏感性最強，氧化后最容易發生肽鏈的斷裂，分解成蛋白亞基或肽類，蛋白損失最為嚴重。從圖2可以更直觀地看出，氧化后方框內的蛋白豐度顯著下降。氧化后豐度顯著增加的點有942、1417、1398和1491等17 個蛋白點，推測這些蛋白可能是肌球蛋白或肌動蛋白等的亞基或碎片。這與前面S1和Rod部位的研究結果一致。

圖2 未氧化與氧化MP的雙向電泳對比模式圖Fig.2 2-DE profiles of non-oxidized and oxidized MP

圖3 未氧化與氧化MP的差異表達蛋白強度對比圖Fig.3 Spot intensity of differentially expressed proteins between nonoxidized and oxidized MP

2.3 氧化MP與添加CE后氧化蛋白的雙向電泳圖譜及差異蛋白分析

為研究CE添加對氧化后蛋白組學變化模式的影響，研究將添加CE后氧化的樣品進行雙向電泳實驗。從添加CE組的雙向電泳圖譜中得到蛋白點1 548 個、差異蛋白點18 個。

由圖4 可知，在M P 中添加C E 后氧化，差異點1564、1994、1836和1535等15 個蛋白點的豐度顯著下降（＜0.05）。由前期研究可以初步推斷這些蛋白可能是肌球蛋白或肌動蛋白等MP主要蛋白的亞基或蛋白碎片，這可能是未添加CE氧化沒有得到有效控制，使許多蛋白的肽鏈發生斷裂，形成了較多的蛋白碎片或亞基。從圖5可以更直觀地看出，添加CE后方框內的蛋白豐度顯著下降。這一假設還需要后續的質譜鑒定作為進一步的支持。添加CE后氧化的樣品中，豐度顯著增加的蛋白點只有1181、1795和1900三個蛋白點（圖4），從圖5也可以清晰地看到這些蛋白質氧化后強度明顯增加，推斷這些蛋白可能是構成MP結構中天然的、沒有被分解的蛋白，并且由于受到了CE的抗氧化保護而得以較完整地存在。這個假設同樣需要質譜鑒定作為進一步的支持。

圖4 氧化MP與添加CE后氧化MP的差異表達蛋白強度對比圖Fig.4 Spot intensity of differentially expressed proteins of oxidized MP versus oxidized MP after addition of CE

圖5 氧化MP與添加CE后氧化MP的雙向電泳對比模式圖Fig.5 2-DE proflies of oxidized MP versus oxidized MP after addition of CE

2.4 豬MP氧化及添加CE后氧化的差異蛋白點的鑒定與分析

根據上述實驗結果，選擇差異顯著的蛋白點進行鑒定，共篩選23 個蛋白點進行質譜鑒定，鑒定成功的蛋白點共計18 個，如表2所示。

如圖3、表2和圖6所示，氧化后豐度明顯增加的點942和1340鑒定為豬肌球蛋白重鏈-4（MHC-4），點1417、1132和1357鑒定為類豬肌球蛋白重鏈-2（MHC-2），點1398鑒定為豬肌球蛋白重鏈-1（MHC-1），這些蛋白都屬于豬骨骼肌MHC的一部分，但一維SDS-PAGE中，MHC的含量是隨氧化程度的增加而減少的，與此結果相矛盾。分析表2中的分子質量不難發現，這些蛋白點的實際分子質量遠小于理論分子質量，從而斷定這些蛋白點并不是完整的MHC，而是MHC斷裂后產生的碎片，這些碎片在氧化后大量增加。這與Malheiros和Poleti等采用蛋白質組學方法對蛋白質氧化損傷的研究結果一致。點1837鑒定為鈣調節磷酸酶結合蛋白-1，該蛋白是-肌動蛋白素和-細絲蛋白結合的一種蛋白，存在于骨骼肌的Z線上，被氧化后會顯著增加，說明氧化可能促進了該蛋白與小的蛋白碎片發生聚合，從而增加了強度。點926鑒定為豬肌球蛋白連接蛋白H亞型X1。點1598和1599鑒定為豬-肌動蛋白帽化亞基的異構體X3，是肌動蛋白結構中的一部分，被氧化后顯著增加。點1719鑒定為MHC碎片，該蛋白點的增強充分說明了氧化導致了MHC肽鏈的斷裂，導致MHC碎片的積累，這與經胰凝乳蛋白酶水解后MP一維電泳的結果一致。

表2 質譜鑒定成功的蛋白質點及相關信息Table 2 List of identified protein spots by MALDI-TOF-MS

圖6 未氧化MP的2-DE圖譜中鑒定成功的蛋白點Fig.6 MS Identified spots in 2-DE protein proflie of non-oxidized MP

如圖4、圖7和表2所示，添加CE后氧化的MP中，豐度下降明顯的蛋白點包括1836和1811，鑒定為豬-肌動蛋白。從圖6和圖7可以明顯地看到，雖然1348和1436也鑒定為豬-肌動蛋白，但這兩個蛋白點的實際分子質量遠大于點1836和1811的分子質量，表明1836和1811并不是完整的-肌動蛋白，而是-肌動蛋白產生的碎片，這說明CE有效地抑制了-肌動蛋白的氧化損失，印證了前面的假設。1799鑒定為豬MHC碎片，這也印證了前面的假設，說明CE有效地抑制了MHC中肽鍵的氧化斷裂，從而降低了MHC碎片的氧化積累。在添加CE后氧化的MP中，豐度顯著增加的點很少，已鑒定的只有1181一個蛋白點，為豬-烯醇化酶，屬于糖酵解途徑中的酶類，說明CE能夠保護-烯醇化酶，使其免受氧化作用而損失掉。鑒定到的-烯醇化酶分子質量與實際分子質量差異不大，因此確定其為完整的蛋白。蛋白點1815鑒定為豬熱休克蛋白-1。雙向電泳的結果也進一步證實了，CE能夠通過控制完整蛋白的氧化損失抑制MHC等大分子蛋白碎片的增加。

圖7 氧化MP的2-DE圖譜中鑒定成功的蛋白點Fig.7 MS identified spots in 2-DE protein profile of oxidized MP

表3是MHC-4中部分肽段的質譜鑒定結果，可以清晰地發現，羥自由基誘發的MP氧化主要修飾的氨基酸部位是甲硫氨酸和半胱氨酸，這種修飾也代表了本研究中其他蛋白殘基的修飾方式。氧化后，半胱氨酸主要形成二硫鍵，甲硫氨酸主要形成亞砜甲硫氨酸，這與Park等采用羥自由基氧化豬MP的結果一致。

表3 質譜鑒定中MP氧化的主要修飾部位和氨基酸Table 3 Main modification sites and amino acids of oxidized MP identified by MS

3 結論

一維電泳結果表明，CE的添加顯著地抑制了肌球蛋白頭部和尾部的氧化損失，而CE對S1部位的保護作用更加明顯；另外，肌動蛋白含量隨氧化程度的加強而增加，主要是通過二硫鍵與Rod和S1的片段交聯而形成。雙向電泳和質譜鑒定結果顯示，氧化后豐度明顯下降的點1815鑒定為豬熱休克蛋白-1，說明該蛋白受羥自由基氧化非常敏感；氧化后豐度增加的蛋白主要是MHC和肌動蛋白的碎片，CE的添加顯著抑制蛋白碎片的產生，顯著提高-烯醇化酶等完整蛋白的豐度。肽段的質譜鑒定結果顯示，羥自由基誘發的MP氧化主要修飾的氨基酸部位為甲硫氨酸和半胱氨酸，氧化后半胱氨酸主要形成二硫鍵，而甲硫氨酸主要形成亞砜甲硫氨酸。因此，該項研究結果表明在肉制品加工與貯藏中添加CE可以改善肉制品的功能特性，也為MP與CE的互作機理研究提供一定的理論支持。