基于ICP-MS的灘羊骨骼礦質元素溯源指紋圖譜

王雪蓉，羅瑞明，李亞蕾，馬夢斌

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

鹽池灘羊肉質細嫩鮮美，不腥不膻，獨具特色。近年來，灘羊被其他地方引進，但未能保持其原有品質特性，冒用、濫用品牌現象阻礙灘羊產業的穩定健康發展及地方特色產業保護[1-2]。因此，對標識鹽池灘羊的副產品羊骨進行原產地溯源鑒定，建立一種快速高效的肉骨鑒別技術，完善灘羊品種保護體系，是當前亟需解決的問題。

原產地是影響骨產品商業價值的重要因素之一，比較常見的溯源方法有信息編碼技術[3]、氣相色譜法[4]、近紅外光譜法[5]、電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法[6-8]、能量散射X射線熒光光譜方法[9]等。骨骼作為體內礦質元素主要的儲存部位，可以通過測定骨礦質元素含量進行區域鑒別。ICP-MS對礦質元素檢出限低、選擇性好，被廣泛使用[10]。張欣昕[11]、駱仁軍[12]等用礦質元素含量結合穩定同位素比值法分別對馬鈴薯、中華絨螯蟹進行產地鑒別，判別正確率均高于90.00%；Qi Jing等[13]利用機器學習輔助礦質元素分析區分中國不同產地的豬肉，總體準確率達95.71%；Zhang Hongru等[14]研究證明多元素分析結合線性判別模型是保證牦牛骨樣品信息可靠性的有效方法。此外，礦質元素也被廣泛應用于中國海參[15]、綠茶[16]、番茄[17]、葡萄酒[18]、牛羊肌肉組織[19-20]等產品的原產地溯源方面。這些研究充分說明基于礦質元素的原產地鑒別技術對同一物種不同產區的鑒別相對較快、準確性較高，具有很大的原產地區分潛力[21-22]。灘羊骨骼作為灘羊資源的一種副產品，國內外研究相對較少，可通過建立灘羊骨骼礦質元素溯源指紋圖譜對其進行區域鑒別與保護。

本研究在已建立的灘羊肉原產地鑒別模型基礎上，利用ICP-MS測定灘羊骨骼中25 種（Ag、Ba、Be、Ca、Cd、Cu、Co、Cr、Cs、K、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Te、V、Zn）礦質元素含量，通過方差分析、主成分分析（principal components analysis，PCA）、聚類分析等多元統計方法，建立灘羊骨骼礦質元素溯源指紋圖譜，采用Fisher判別驗證模型有效性，為灘羊骨骼的原產地鑒別和檢測冒充、摻假灘羊骨產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集寧夏鹽池縣（麻黃山鄉、高沙窩鎮、馮記溝鄉）、內蒙古自治區鄂托克前旗、陜西省定邊縣和甘肅省環縣4 地7 月齡灘羊頭骨、脊骨、四肢骨、肋骨樣品，共計240 個樣本，具體信息見表1。

表1 樣品采集信息Table 1 Information of sheep bone samples

氫氟酸（MOS級） 上海旭恒商貿有限公司；高氯酸（MOS級） 南京化學試劑有限公司；Ca、Fe、Ni、Mn、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、Rb、Sn、P、Na、K、Mg、V、Cr、Co、Cs、Sb、Ba、Be、Cd、Te、Ag（1 000.00 μg/mL）元素標準溶液 北京儀化通標科技有限公司；Dura series超純水處理系統（＞18.20 MΩ·cm） 上海和泰儀器有限公司；濃硝酸（65.00%）、濃鹽酸（37.00%） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FA-1004冷凍干燥機 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；冷凍球磨儀 德國Restsch公司；WX-8000微波消解儀 上海新儀微波化學科技有限公司；iCAPQ ICPMS儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將采集的骨骼樣品剔除表面肉、肌腱和其他雜質，分別稱取100.00 g，冷凍干燥48 h，粉碎研磨成粉末狀，過200 目篩，備用。

1.3.2 樣品消解

稱取粉末狀樣品0.15 g至聚四氟乙烯消解罐中，加入2.00 mL雙氧水、6.00 mL濃硝酸預消解20 min，然后放入微波消解儀中消解。消解程序：0～10 min，由0 ℃以18 ℃/min速率升高到180 ℃，保持5 min；在10 min內以6 ℃/min速率上升到240 ℃，保持25 min；最后，通風趕酸10 min，得到消解溶液。取消解液1.00 mL定容至50 mL，開始測樣，同時做空白實驗。

1.3.3 元素含量測定

使用ICP-MS儀測定灘羊骨骼樣品中Ag、Ba、Be、Ca、Cd、Cu、Co、Cr、Cs、K、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Te、V、Zn 25 種礦質元素含量，結果以每千克樣品干質量計。氬用于等離子體產生，添加內部標準（In、Ge、Sc元素）以補償任何酸效應和儀器漂移。具體參數如下：掃描速率5 000 u/s；射頻發生器功率1 550 W；分辨率0.30～3.00 u；質量范圍1～285 u；霧化氣流量1.12 L/min；載氣流量0.98 L/min；樣品提升速率1.20 L/min；冷卻氣流量14.00 L/min；駐留時間50.00 ms；離子透鏡電壓8.25 V；每質量數采集數據點50.00 ms；積分時間500.00 ms。樣品中測定元素的含量按下式計算：

式中：x為試樣中待測元素含量/（mg/kg）；ρ1為試樣溶液中被測元素質量濃度/（mg/L）；ρ0為試樣空白液中被測元素質量濃度/（mg/L）；V為試樣消化液定容體積/mL；f為稀釋倍數；m為試樣稱取質量/g。

1.4 數據處理

采用Office 2019、SPSS 23.0軟件對礦質元素含量數據進行處理并作方差分析、PCA、K-均值聚類等多元統計分析。

2 結果與分析

2.1 礦質元素含量測定結果的準確性分析

對所有樣本中25 種礦質元素含量進行檢測，各元素回歸方程、相關系數、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）和檢出限（limit of detection，LOD）見表2。

表2 各元素線性回歸方程、相關系數、RSD和LODTable 2 Linear regression equations,correlation coefficients,RSDs,and LODs for various metal elements

選擇擬合性較好的質量濃度范圍繪制標準曲線，如表2所示，P、Se、Sn、Te 4 種礦質元素線性方程相關系數大于0.990 0，其余20 種礦質元素線性方程相關系數均大于0.999 0，RSD均小于7.00%。測定時用空白樣品對儀器進樣8 次，計算得出各元素LOD在0.001 3～3.306 0 μg/L范圍內，說明該方法可用于檢測灘羊骨骼礦質元素含量。

2.2 不同產地灘羊骨骼礦質元素分析

如表3所示，灘羊骨骼樣品中Ba、Ca、Cd、Cu、Cr、Cs、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Sn、Se、Sr、Te、V、Zn 21 種礦質元素在4 個地區間存在顯著差異（P＜0.05），Be、Co、K元素在4 個地區間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同地區間灘羊骨骼中礦物元素含量Table 3 Contents of mineral elements in Tan sheep bones from four county-level regions

內蒙古鄂托克前旗樣品中Ba、Cr、Na、Ni、Sr、Te、V含量在4 個地區間最高，Cd、Mn、P含量最低；甘肅環縣樣品中Cd、Mg含量在4 個地區間最高，Fe、Se 2 種元素含量最低；寧夏鹽池縣樣品中Ca、Cu、Fe、K、Mn、P、Rb和Se 8 種礦質元素含量相對其他3 個地區最高，Ba、Ni、Te 3 種礦質元素含量顯著低于其他3 個地區，高含量礦質元素相對較多；陜西定邊縣樣品中Cs、Ni、Zn含量在4 個地區間最高，Sr、V 2 種元素含量最低。由此可見，不同產地灘羊骨骼元素組成分布特征各異，且相同礦質元素在不同產地灘羊骨骼中含量也差異顯著。在此基礎上，對寧夏鹽池灘羊骨骼中礦質元素進一步分析，篩選顯著性差異礦質元素，對其建立特有骨骼礦質元素產地溯源指紋圖譜。

2.3 寧夏鹽池縣灘羊骨骼中礦質元素含量差異分析

對寧夏鹽池縣馮記溝鄉、高沙窩鎮、麻黃山鄉灘羊骨骼中25 種礦質元素含量作方差分析，如表4所示，P、Na、V、Mg、Ca、Cr、Be、Mn、Zn、Se、Sr、Cd、Cs、Ba、Rb、Te 16 種礦質元素含量在寧夏鹽池縣3 個地區間存在顯著差異（P＜0.05）。

表4 寧夏鹽池縣馮記溝鄉、高沙窩鎮、麻黃山鄉灘羊骨骼中礦物元素含量Table 4 Contents of differential mineral elements among Tan sheep bones from Fengjigou,Gaoshawo and Mahuangshan in Yanchi,Ningxia

生物體中礦質元素含量特征與地區密切相關[23]。馮記溝鄉灘羊骨骼中Ca、Cs、Mn、Rb、Se含量最高，其中僅Se含量與高沙窩鎮差異不顯著，Ba和Sr 2 種礦質元素含量顯著低于其他兩地；高沙窩鎮灘羊骨骼中Ba、Be、Cd、P、Zn 5 種礦質元素含量高于麻黃山鄉和馮記溝鄉，其中Ba、Be和Zn含量顯著高于麻黃山鄉和馮記溝鄉，而Rb、V含量顯著低于其他兩地；麻黃山鄉灘羊骨骼中Cr、Na、Mg、Sr、Te、V含量高于其他兩地，其中Cr、Mg和Sr含量顯著高于馮記溝鄉和高沙窩鎮，Cs、Cd、Se含量顯著低于馮記溝鄉和高沙窩鎮。可見，灘羊骨骼中礦質元素分布在小范圍相似地區間也存在差異，若將此特征作為產地鑒別標識還存在不足，需將鹽池縣灘羊飼養代表性地區骨骼中具有顯著差異的礦質元素進一步作多元統計分析。

2.4 寧夏鹽池縣灘羊骨骼中礦質元素的PCA

PCA通過降維思想研究實驗各項指標的內在關系，在保留80%以上原有信息基礎上，將多項指標減少為幾個相互獨立的綜合指標[24]。相比其他統計學分析方法，PCA確定的權數是基于大量數據分析得到的指標間內在結構關系，不受主觀因素影響，降維后得到的PC間彼此獨立，避免信息交叉，使分析結果更加客觀、可靠[25-26]。

對寧夏鹽池縣馮記溝鄉、高沙窩鎮、麻黃山鄉灘羊骨骼中16 種含量差異顯著的礦質元素進一步作PCA。由圖1可知，馮記溝鄉、高沙窩鎮、麻黃山鄉3 地灘羊骨骼礦質元素中具有顯著差異的元素前4 個PC累計方差貢獻率分別達到85.90%、81.20%、85.50%，基本保留了原元素的變化信息。結合圖2可以非常直觀地看出，馮記溝鄉PC1主要由P、Na、Mg、Ca、Mn、Zn等構成，PC2由Rb、Cd、Se、Ba 4 種元素構成；PC3由Cs、Te構成；高沙窩鎮PC1主要由P、Na、Ca、Mn、Zn、Te等元素構成，PC2主要由Cs、V、Cd 3 種元素構成，PC3由Rb構成；麻黃山鄉PC1主要由P、Na、Mg、Ca、Zn、Cd等構成，PC2由Cs、Ba、Rb 3 種元素構成。PCA可以直觀地表現灘羊骨骼中16 種礦質元素分布特征，找到不同地區間差異顯著的特征元素，為產地指紋圖譜構建提供理論依據。

圖1 馮記溝鄉（a）、高沙窩鎮（b）、麻黃山鄉（c）灘羊骨骼中礦質元素PC碎石圖Fig.1 PCA scree plot of mineral elements in Tan sheep bones from Fengjigou (a),Gaoshawo (b) and Mahuangshan (c)

圖2 馮記溝鄉（a）、高沙窩鎮（b）、麻黃山鄉（c）灘羊骨骼中礦質元素PC載荷網絡圖Fig.2 PCA loading network plot of mineral elements in Tan sheep bones from Fengjigou (a),Gaoshawo (b) and Mahuangshan (c)

2.5 寧夏鹽池縣灘羊骨骼中礦物元素含量聚類分析

聚類即根據樣品間相似程度進行簡化合并分組，相似性最大的元素優先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質將多個樣品聚合，使結果具有最大的組內相似性和最小的組間相似性[27-28]。采用K-均值聚類對鹽池灘羊骨骼中礦質元素所取得的主要成分貢獻值進行聚類分析，由表5可知，馮記溝鄉灘羊骨骼中16 種礦質元素指標被聚為3 類：第1類包括Ca、Mn、Na、P、Se、Zn；第2類包括Be、Cs、Mg、Rb、Te，第3類包括Ba、Cd、Cr、Sr、V，結合2.4節PCA結果，Ca、Mg、Mn、Na、P、Rb、Se、Zn這8 種元素可以作為馮記溝鄉灘羊骨骼的礦質元素溯源指標。高沙窩鎮灘羊骨骼中16 種礦質元素指標被聚為3 類：第1類包括Be、Ca、Mn、Na、P、V、Te、Zn；第2類包括Ba、Cd、Cs、Mg、Se，第3類包括Cr、Rb、Sr，結合2.4節PCA結果，Ca、Cd、Cs、Mn、Na、P、Te、Zn這8 種元素可以作為高沙窩鎮灘羊骨骼的礦質元素溯源指標。麻黃山鄉灘羊骨骼中16 種礦質元素指標被聚為3 類：第1類包括Ca、Cd、Mg、Mn、Na、P、Se、Zn；第2類包括Be、Cr、Cs、Rb、Sr、Te，第3類包括Ba、V，結合2.4節PCA結果，Ca、Cd、Cs、Mg、Na、P、Rb、Zn這8 種元素可作為麻黃山鄉灘羊骨骼的礦質元素溯源指標。綜上所述，Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn這10 種礦質元素可以作為鹽池縣灘羊骨骼中礦質元素的溯源指標。

表5 馮記溝鄉、高沙窩鎮、麻黃山鄉灘羊骨骼中礦質元素含量聚類分析結果Table 5 Cluster analysis of mineral elements in Tan sheep bones from three towns in Yanchi county

2.6 寧夏鹽池灘羊骨骼中礦物質元素的判別分析

選取采集的陜西定邊縣、內蒙古鄂托克前旗、寧夏鹽池縣和甘肅環縣4 地灘羊骨骼樣品，測定其礦質元素含量，檢驗已篩選出的溯源指標對隨機灘羊骨骼樣品產地鑒別效果。利用2.5節中鹽池灘羊骨骼溯源指標中的10 種元素（Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn）建立判別模型。在0.05顯著性水平上，將Ca、Cs、Mg、Mn、Se、P、Te 7 種對地域判別顯著的元素引入到Fisher判別模型中。具體判別模型如下：

y1＝71.07x1＋49.88x2－0.24x3－412.01x4＋11.05x5＋163.16x6－8.63x7－1 217.90

y2＝194.25x1－18.70x2＋0.14x3＋208.19x4－6.53x5＋107.54x6＋5.27x7－423.76

y3＝64.44x1－23.74x2＋0.10x3＋216.45x4＋5.59x5＋66.30x6＋4.17x7＋263.07

y4＝53.98x1＋14.52x2＋0.06x3＋321.12x4＋3.99x5－27.75x6＋1.98x7－122.76

式中：y1、y2、y3、y4分別為寧夏鹽池縣、內蒙古鄂托克前旗、甘肅環縣、陜西定邊縣4 個地區模型計算值；x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7分別為Ca、Cs、Mg、Mn、Se、P、Te含量/（mg/kg）。

利用此判別模型對樣品進行歸類，將礦質元素含量測定值代入上述模型中計算，比較所得y值，將樣品歸為y值最大的一類，并結合回代檢驗和交叉檢驗對模型有效性進行驗證。由表6可知，灘羊骨骼樣品來源整體判別效果較好。4 個地區的回代檢驗和交叉檢驗的整體正確率均在85.00%以上，其中對寧夏鹽池縣的判別效果最好，回代檢驗和交叉檢驗正確率均達90.00%。陜西定邊縣骨骼樣品被錯判為內蒙古鄂托克前旗和甘肅環縣，致使檢驗正確率稍低，同時，其他地域被錯判的樣品多被錯判為陜西定邊縣樣品，可能是其中差異不顯著元素占比較大，區分性不高。此外，寧夏鹽池縣和甘肅環縣樣品也存在相互錯判。

表6 4 個地區灘羊骨骼樣品的LDA結果Table 6 LDA results of Tan sheep bone samples from four county-level regions

對樣品前2 個判別函數得分作散點圖，如圖3所示，每個地區樣品均被較好的歸類，各具空間分布特征，這與PCA、聚類分析結果基本一致，Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn可作為鹽池灘羊骨骼礦質元素指紋圖譜，表明篩選出用作灘羊骨骼產地鑒別的10 種礦質元素是有效的，并且利用該10 種元素指標建立的判別模型亦有效。

圖3 灘羊骨骼樣品的前兩個判別函數得分散點圖Fig.3 Scatter plot of Tan sheep bone samples on the first two discriminant functions

本研究中篩選的礦質元素溯源指紋圖譜，整體正確判別率約為85.00%，與Sun Shumin[19]、Zhang Hongru[14]等的研究結果相比，判別正確率較低，可能是土壤、氣候、飼喂草料等諸多因素對礦質元素含量有影響，進而影響判別結果[29-30]。后期擬添加氣候、土壤等環境因素，采集大樣本量，結合具有地域代表性的穩定同位素、化學計量方法進行研究，繼續完善指紋圖譜信息，提高判別正確率，從而有效區分不同產地灘羊骨骼，為羊骨的產地鑒別提供理論依據。

3 結論

通過對寧夏鹽池縣、內蒙古鄂托克前旗、甘肅環縣和陜西定邊縣4 個地區灘羊骨骼中25 種（Ag、Ba、Be、Ca、Cd、Cu、Co、Cr、Cs、K、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、Te、V、Zn）礦質元素含量進行測定，運用PCA等多元統計分析方法得出以下結論：1）灘羊骨骼樣品中Ba、Ca、Cd、Cu、Cr、Cs、Fe、Mg、Mn、Mo、Na、Ni、P、Rb、Se、Sr、Te、V、Zn 19 種礦質元素在4 個地區間存在顯著差異，內蒙古鄂托克前旗樣品中Ba、Cr、Na、Ni、Sr、Te、V含量在4 個地區間最高，甘肅環縣樣品中Cd、Mg含量最高，寧夏鹽池縣樣品中Ca、Cu、Fe、K、Mn、P、Rb、Se含量最高，陜西定邊縣樣品中Cs、Ni、Zn含量最高，不同產地間灘羊骨骼的組成元素各具分布特征，同時相同礦質元素在不同原產地間也差異顯著。2）篩選出鹽池灘羊骨骼礦質元素指紋溯源圖譜為Ca、Cd、Cs、Mg、Mn、Na、P、Rb、Te、Zn，通過Fisher判別，Ca、Cs、Mg、Mn、Se、P、Te 7 種礦質元素被引入判別模型中，回代檢驗的整體正確判別率為87.50%，交叉檢驗的整體正確判別率為86.87%，建立的礦質元素溯源指紋圖譜可用于區分不同地區灘羊骨骼。