生菜生產到消費全程金黃色葡萄球菌的定量風險評估

瞿 洋，何昭穎，周昌艷，林 婷，杜遠芳，馬智宏，索玉娟,

（1.上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201403；2.上海科立特農產品檢測技術服務有限公司，上海 201106；3.北京農業質量標準與檢測技術研究中心，農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（北京），北京 100097）

過去20 年間，消費者在健康飲食方面態度和行為的轉變增加了即食農產品的消費量[1]。即食是一種不經加熱直接食用的飲食方式，若其食用的農產品被病原微生物污染，則會對人體健康產生一定風險。1980—2016年，全球因即食農產品共引起571 起食物中毒事件，導致72 855 人患病，其中50%的事件由即食綠葉菜引起[2]。生菜作為沙拉制作的主要菜品，是我國消費最多的一類即食蔬菜。容冬麗等[3]發現我國生菜中金黃色葡萄球菌污染率為5.9%，具有潛在的致病風險。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是我國第3大食源性致病菌[4]，一般認為其濃度大于105CFU/g（mL）時會產生耐熱腸毒素，進而引發食物中毒[5-7]，出現惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀[8-9]。

為預防金黃色葡萄球菌食物中毒，歐美等國已將食品安全關注點從食源性疾病暴發的事后調查轉移至食品污染的早期評估。微生物定量風險評估（quantitative microbial risk assessment，QMRA）運用數學和邏輯語言構建模型，定量分析危害人體健康的潛在因素，科學指導管理者制定有關管理守則，降低食品風險[9]。目前，國內外金黃色葡萄球菌定量風險評估主要集中于乳及乳制品、肉及肉制品[10-14]，果蔬相關研究較少；而生菜中金黃色葡萄球菌的研究多集中于預測模型的構建[15]，QMRA研究尚處于空白階段。因此，定量分析即食生菜中金黃色葡萄球菌的危害，對預防該組合引起的食物中毒具有重要參考意義。

基于此，本研究從生菜種植環節入手，重點排查大棚和露地這兩種常見種植方式中各環境因素及產品的污染數據，結合我國居民的消費習慣和金黃色葡萄球菌在生菜中的生長與失活模型，分析得出生菜從生產種植到供應銷售及食用各模塊的相關參數值，進而從危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述4 個方面對我國生菜中的金黃色葡萄球菌進行全程定量風險評估。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤、肥料和灌溉水樣本來自上海和北京地區143 家生菜種植基地（大棚及露地），其中大棚樣本：土壤51 份、灌溉水44 份、肥料27 份；露地樣本：土壤92 份、肥料20 份、灌溉水25 份。所有樣本均在2 h內送達實驗室。

7.5 %氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Baird-Parker（BP）培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、兔血漿 北京陸橋技術有限責任公司；氯化鈉上海博蘊生物科技有限公司；腦心浸出液肉湯 英國Oxoid公司。

1.2 儀器與設備

SX-500高壓滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司；1300 SERIES A2型生物安全柜 美國Thermo公司；Medcenter Einrichtungen GmbH恒溫培養箱 德國Friocell公司；AL104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Vortex Genie 2旋渦混勻儀 美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

依據國際食品法典委員會頒布的C A C/G L-3 0（1999）《微生物風險評估原則和指南》，對生菜中的金黃色葡萄球菌從危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述4 個方面進行定量風險評估。

危害識別、危害特征描述：通過查閱相關專著、教材、國內外文獻或評估報告，收集金黃色葡萄球菌的危害特征資料。

暴露評估：從生菜種植生產環境中金黃色葡萄球菌的初始污染水平開始，以食用消費者發病率結束，涉及生菜種植、供應鏈、銷售及食用環節。按照GB 4789.10—2016《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》中MPN計數法[16]對土壤、肥料和灌溉水進行定量檢測，本實驗中假設單位MPN可與CFU互換；金黃色葡萄球菌生長數據：生菜中金黃色葡萄球菌的二級生長模型參考本課題組前期研究（μmax=0.021×（T－14.958）[1－e5.175（T－40.193）]，其中μmax表示最大比生長速率/h－1；T表示溫度/℃；λ=0.024 23T2－1.979 32T＋42.124 97，其中λ表示遲滯期/h；T表示溫度/℃）；其他數據參考文獻[1,11-12,17-25]。暴露評估模型采用拉丁超立方抽樣方法進行蒙特卡洛模型模擬，模型每次模擬包括10 000 次迭代運算，每次運算時計算機從模型每個概率分布中抽取1 個值，以這些隨機抽取的數值進行運算。

風險特征描述：在危害識別、危害特征描述、暴露評估的基礎上，考慮不確定性因素，確定人群即食含有金黃色葡萄球菌污染的生菜引起疾病的概率，評估結果以每年即食生菜導致金黃色葡萄球菌中毒的人數表示，并通過敏感性分析，提出合適的風險管理措施。

1.4 數據統計分析

應用Microsoft Excel 2010軟件進行檢測數據的統計及風險特征描述，用@Risk 5.5軟件的分布擬合功能對暴露評估數據進行隨機分布擬合統計分析。

2 結果與分析

2.1 危害識別

金黃色葡萄球菌為無芽孢和鞭毛的革蘭氏陽性菌，生長溫度范圍為6.5～50 ℃，最適生長溫度37 ℃，能在pH 4.5～9.3條件下生長，最適pH 7.4。金黃色葡萄球菌對熱、干燥及高滲環境具有較高抗性[26-27]，可產生大量的胞外酶和代謝產物。一些菌株產生的耐熱腸毒素（在100 ℃、30 min條件下仍有活性），可引起金黃色葡萄球菌感染或食物中毒[28]。2017年中國食源性疾病暴發事件監測資料顯示，金黃色葡萄球菌腸毒素食物中毒事件僅少于副溶血性弧菌和沙門氏菌[1]。

2.2 危害特征描述

金黃色葡萄球菌產生腸毒素引起的食物中毒癥狀出現較快，一般為2～8 h，包括惡心、嘔吐或干嘔，腹部痙攣、發汗、發冷、衰竭、脈軟、休克、呼吸弱和低溫等癥狀，伴有腹瀉或無腹瀉癥狀[26-27]。劑量-反應曲線的終點以急性胃腸疾病的發病界定。國際公認的金黃色葡萄球菌腸毒素閾值為1.0 μg[22]，一般認為食物中金黃色葡萄球菌含量達到105CFU/g即可達到上述毒素量，本次評估以105CFU/g作為金黃色葡萄球菌食物中毒的閾值標準。

2.3 暴露評估

2.3.1 生菜種植環節中各環境樣本的污染情況

2019—2020年上海和北京地區大棚及露地生菜種植過程中土壤、肥料、灌溉水中金黃色葡萄球菌含量的監測數據顯示，大棚種植環境中51 份土壤有1 份陽性檢出，陰性樣本為50 份；44 份灌溉水和27 份肥料中金黃色葡萄球菌均未檢出；露地種植模式下，92 份土壤、20 份肥料和25 份灌溉水均無金黃色葡萄球菌檢出，故本次評估主要以大棚生菜為主。

以Beta（np＋1，nn＋1）分布形式表示土壤中金黃色葡萄球菌的初始污染率，其中np為陽性樣本數，nn為陰性樣本數，即土壤中金黃色葡萄球菌的初始污染率Pp為Beta（2，51），陰性污染率Pn為1－Pp。按照最大保護原則，土壤陽性樣本中金黃色葡萄球菌數Lp為3.04（lg（CFU/g）），根據Jarvis[29]所述公式估計陰性樣本中金黃色葡萄球菌污染水平Ln平均值，由其反向偏斜累計概率分布表示。最終，以離散函數Discrete（Lp∶Ln，Pp∶Pn）描述土壤中金黃色葡萄球菌的初始污染水平，結果見圖1，其90%置信區間的污染率變化范圍為－8.72～3.01（lg（CFU/g）），平均值為－2.87（lg（CFU/g））。

圖1 土壤中金黃色葡萄球菌的污染水平分布模擬Fig.1 Fitted distribution of S.aureus contamination level in soil

2.3.2 生菜種植過程中金黃色葡萄球菌的變化

種植過程主要關注灌溉及采收引起大棚生菜中金黃色葡萄球菌污染水平的變化，假設種植過程中生菜上的金黃色葡萄球菌不生長，各階段金黃色葡萄球菌的污染水平見圖2。

圖2 生菜種植過程中各階段金黃色葡萄球菌的污染水平分布模擬Fig.2 Fitted distribution of S.aureus contamination level in lettuce plantation

大棚生菜一般采用自來水或地下水進行灌溉，灌溉方式有噴灌和滴管兩種，較為常見的為噴灌，故本研究選擇噴灌方式進行后續計算。根據30 家生菜基地的調研結果及生菜種植文獻[17-18]，生菜的平均灌溉周期為8 d（90%置信區間6.20～9.80 d）；在使用噴灌灌溉生菜時，會有0.28（5%）～0.52（95%）的概率出現水濺現象，導致每克生菜增加0.06（5%）～15.36 g（95%）土壤。灌溉后，生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平為－8.95（5%）～2.86（lg（CFU/g））（95%），平均值－3.07（lg（CFU/g））。

生菜通常使用刀具進行收割，該步驟使每克生菜增加了－0.008～0.002（lg（CFU/g））（90%置信區間）金黃色葡萄球菌。生菜采收后，金黃色葡萄球菌的污染水平為－8.95～2.86（lg（CFU/g））（90%置信區間），平均值為－3.07（lg（CFU/g））。

2.3.3 生菜從市場到餐桌過程中金黃色葡萄球菌的變化

2.3.3.1 銷售至家庭貯藏過程中生菜暴露溫度和暴露時間的概率分布

生菜從市場到餐桌主要歷經：農田到市場的運輸、市場銷售、市場到家庭的運輸、家庭貯藏4 個環節，各環節溫度和時間的概率分布如表1所示。運輸和市場銷售部分通常為常溫，采用Triang（－17.6，28，31.8）函數擬合全國氣溫分布，從擬合結果可以看出，常溫下全國平均氣溫為14.07 ℃，90%置信區間為－6.99～28.74 ℃。消費者調研結果顯示，生菜貯藏有常溫貯藏也有冷藏貯藏，假設其比例為1∶1，參考文獻[22]使用函數Uniform（0，8）擬合冰箱冷藏室貯藏溫度，最終家庭貯藏擬合溫度平均值為8.99 ℃，90%置信區間為－2.72～27.37 ℃。生菜從農田到市場的運輸時間為8.32（5%）～20.71 h（95%），平均值為14 h；市場銷售時間參考文獻[1,21]結合我國市場實情進行模擬校正，其范圍為4.18（5%）～20.24 h（95%），平均值為12.17 h；市場到家庭的運輸時間為0.58（5%）～1.93 h（95%），平均值為1.25 h；家庭貯藏時間依據最大化原則，以冰箱冷藏時間為主，即生菜家庭貯藏時間為3.60～68.40 h，平均值為36.00 h。

表1 銷售至家庭貯藏過程中生菜暴露溫度和暴露時間的概率分布Table 1 Possibility distribution of exposure time and temperature during transportation and storage

2.3.3.2 銷售至家庭貯藏過程中生菜金黃色葡萄球菌的變化

生菜從農田到市場的運輸、市場銷售、市場到家庭的運輸均在常溫下進行，故3 個階段μmax和遲滯期相同，μmax平均值為－0.018 h－1（90%置信區間為－0.461～0.289 h－1），遲滯期平均值為22.13 h（90%置信區間為5.3～57.1 h）；家庭貯藏環節中μmax平均值為－0.124 h－1（90%置信區間為－0.374～0.261 h－1），遲滯期平均值為24.23 h（90%置信區間為－12.1～47.7 h）。

由圖3可知，在農田到市場的運輸中，生菜中金黃色葡萄球菌數為－8.60（5%）～3.52（lg（CFU/g））（95%），平均值為－2.42（lg（CFU/g））；市售生菜中金黃色葡萄球菌數為－8.17（5%）～4.14（lg（CFU/g））（95%），平均值為－1.93（lg（CFU/g））；購買回家時生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平與市售生菜一致；經過家庭貯藏，清洗前生菜中金黃色葡萄球菌數為－7.78（5%）～5.63（lg（CFU/g））（95%），平均值為－0.75（lg（CFU/g））。

圖3 銷售至家庭貯藏過程各階段生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平分布模擬Fig.3 Fitted distribution of S.aureus contamination level in lettuce from sale to home

2.3.3.3 生菜食用環節及發病概率計算

生菜食用前清洗環節的細菌減少量數據來源于文獻[23-24]，采用Uniform（0.39，2）概率分布模型描述生菜表面金黃色葡萄球菌在流水沖洗2 min內的細菌變化規律，其中，90%置信區間下細菌減少量為0.47～1.92（lg（CFU/g））。如圖4所示，食用前生菜中金黃色葡萄球菌的終污染水平為－8.98～4.40（lg（CFU/g）），平均值為－1.95（lg（CFU/g））。

圖4 食用前生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平分布模擬Fig.4 Fitted distribution of S.aureus contamination level in lettuce before consumption

我國居民即食生菜的消費習慣及數量參考文獻[25]，即每人每天即食生菜消費量為9.06 g，90%置信區間為0.1～34.4 g，計算得出每個消費者每天攝入即食生菜感染金黃色葡萄球菌總數為－2.09（lg（CFU/g）），90%置信區間為－9.27～4.53（lg（CFU/g））（圖5）。

圖5 消費者每天食用即食生菜時攝入的金黃色葡萄球菌量Fig.5 Daily per capital intake of S.aureus from consumption of raw lettuce

劑量-反應關系用于描述人體攝入致病菌的數量與居民患病概率的關系，本研究參考文獻[11]采用指數模型P=1－er×N（r表示單一金黃色葡萄球菌引起食物中毒的概率，N表示攝入金黃色葡萄球菌的數量），評估即食生菜中金黃色葡萄球菌對人體健康的危害。根據食用前生菜中金黃色葡萄球菌的污染水分布結合我國居民即食生菜消費水平，預測因即食生菜導致發生金黃色葡萄球菌病的概率見圖6，其平均值為2.72×10－4。

圖6 食用即食生菜導致金黃色葡萄球菌發病概率預測分布圖Fig.6 Incidence probability of S.aureus infection from consumption of raw lettuce

2.3.3.4 暴露評估過程中主要參數匯總

生產到消費全程生菜中金黃色葡萄球菌的暴露評估模型參數詳見表2。

表2 生菜中金黃色葡萄球菌從農田到餐桌的暴露評估模型參數Table 2 Summary of variables and parameters of S.aureus exposure assessment models for lettuce of from farm to table

續表2

2.4 風險特征描述

通過暴露評估輸出數據結合劑量-反應模型計算即食生菜引起的金黃色葡萄球菌病的風險。本模型主要計算即食生菜人口，假設其占我國總人口數1%，通過暴露人數計算我國每年因即食生菜而引起金黃色葡萄球菌患病人數超過77萬（表3）。

表3 我國每年因即食生菜而引起金黃色葡萄球菌患病預期年度風險計算Table 3 Calculation of expected annual risk of S.aureus infection caused by consumption of raw lettuce

2.5 敏感性分析

通過各變量與模型暴露評估結果的Spearman相關性進行敏感性分析，相關系數在－1～1之間，1表示正相關，－1表示負相關，相關系數越接近0表示該因子與模型評估結果的相關性越低。通過相關性分析找到對模型影響最大的變量因素，從而幫助決策者運用有效的風險控制管理措施和手段對主要風險進行控制，降低食品中致病菌的安全風險。

如圖7所示，生菜種植時土壤中金黃色葡萄球菌的初始污染水平對生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平影響最大（相關系數0.75），其次是家庭貯藏溫度（相關系數0.40），清洗、從農田到市場的運輸溫度、灌溉時土壤轉移質量、即食生菜食用頻次和市場銷售溫度（相關系數絕對值為0.1～0.2）。即食生菜攝入量、市場銷售時間、家庭貯藏時間、農田到市場的運輸時間、灌溉時間及灌溉時金黃色葡萄球菌轉移概率對生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平影響效果有限（相關系數絕對值小于0.1）。

圖7 各環節中金黃色葡萄球菌風險的敏感性分析Fig.7 Sensitivity analysis for S.aureus infection in each step

3 討論

本研究定量風險評估結果顯示，我國每年因即食生菜引發的金黃色葡萄球菌中毒概率為2.72×10－4，每年因此導致的金黃色葡萄球菌中毒人數約為77萬。中毒概率與蔡華等[22]預測的上海市涼拌菜中金黃色葡萄球菌引起的食物中毒概率（4×10－4）相似；中毒人數稍大于其預測人數51.81萬 人，并且大于國家突發公共衛生事件報告管理系統顯示2019年因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒人數（1 023 人）[30]。造成中毒人數存在較大差異的主要原因除與模型自身偏差有關外，也與我國食源性疾病監測統計數據的缺失與不完善等情況有較大關系[31]。

由于我國食品微生物定量風險評估處于快速發展階段，本次評估的不確定性主要來源于參數的不確定性和統計的不確定性。首先，本次評估中部分數據處于缺失狀態，如即食生菜的消費習慣及數量使用即食食物的數據進行替代；種植環節中金黃色葡萄球菌的轉移率使用大腸桿菌O157的數據進行替代，使用上海和北京兩地數據替代全國數據；其次，生菜及其環境的陽性樣本濃度較低，采用MPN法進行檢測，后續計算將MPN/g等同于CFU/g。因此，要推動我國食源性致病菌定量風險評估的發展，必須補充完善各環節相應基礎數據以提高定量風險評估的準確性。

在對食用前生菜中金黃色葡萄球菌的評估結果進行敏感性分析過程中發現：1）生菜種植過程中，土壤中金黃色葡萄球菌的初始污染水平對其影響最大，因此控制生菜種植環境的衛生狀況是預防即食生菜金黃色葡萄球菌中毒的關鍵。此外，就大棚和露地兩種種植方式而言，露地種植生菜中金黃葡萄球菌污染較少，可能與陽光照射下的紫外線殺菌作用有關[32]。2）運輸溫度、銷售溫度及家庭貯藏溫度對評估結果影響較大，特別是家庭貯藏溫度。一般來說，溫度越高，微生物細胞膜流動性越強，運輸營養物質能力越快，越有利于微生物的生長[33]。3）清洗過程會減少生菜中的金黃色葡萄球菌。資料顯示，常見的家庭清洗方式最多可減少果蔬表面2（lg（CFU/g））的微生物[34]。

基于本研究結果，為防控即食生菜引起金黃色葡萄球菌食物中毒，建議從以下方面進行重點管控：1）從源頭控制生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平，倡導有條件的基地覆蓋地膜，選用滴灌方式進行灌溉；2）生菜購買后應及時食用或者于冰箱冷藏，減緩金黃色葡萄球菌的生長，控制生菜貯存時間；3）加強廚房衛生習慣宣傳，避免食物交叉污染，注意科學清洗生菜。

4 結論

監測生菜種植過程中土壤、肥料、灌溉水中金黃色葡萄球菌數量，評估生菜中金黃色葡萄球菌從種植、銷售到即食的動態變化及風險情況，預測我國因即食生菜導致金黃色葡萄球菌中毒的概率為2.72×10－4，每年因此引發的食物中毒病例約為77萬 人，同時發現土壤中金黃色葡萄球菌的初始污染水平對生菜中金黃色葡萄球菌的污染水平影響最大，其次為家庭貯藏溫度及食用前清洗過程，提出從控制生菜種植環境、合理使用冰箱及清洗生菜3 方面降低即食生菜引起金黃色葡萄球菌中毒風險，為生產企業和監管部門制定標準提供準確的理論依據。