雞蛋中氟苯尼考質控樣品的研制及穩定性評價

蔡若純，鄧皇翼，劉耀慧，劉鵬展，羅志浩，劉海虹，雷 毅

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

氟苯尼考又稱氟甲砜霉素，是新一代氯霉素類動物專用抗生素，具有抗菌譜廣、毒副作用小等特點，是農業部批準使用的動物專用抗菌藥，被廣泛應用于動物養殖業[1-2]。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[3]規定了不同動物種類的氟苯尼考獸藥最大殘留限量，其中產蛋期禁止使用氟苯尼考。國家食品藥品監督管理局也對氟苯尼考做出風險提示，成人（以60 kg計算）每日從飲食中攝取 0～180 μg的氟苯尼考，正常情況下不會有風險，但長期食用氟苯尼考殘留超標的雞蛋，對人體健康會產生一定危害[4]。

目前氟苯尼考的實驗室檢測方法主要有氣相色譜法[5-7]、高效液相色譜法[8-9]、液相色譜-質譜聯用法等[10-13]，檢出限范圍為0.1～1.0 μg/kg。由于獸藥殘留大部分為痕量檢測，在日常檢測及方法確認過程中，常采用加標回收和基體標準樣品等質控手段進行質量控制[14-15]，但加標回收難以反映出真正陽性樣品的提取效率，而現有基體標準樣品的價格昂貴、基質品種有限，未能滿足實際工作需求。此外，隨著食品快速檢測方法的發展，因快速檢測產品具有操作簡便、成本低、檢測周期短等特點，快速檢測方法和技術逐漸廣泛應用于氟苯尼考獸藥殘留的現場篩查[16-18]。在快速檢測產品[19]和快檢方法評價[20]驗證過程中往往需要自制特定項目、基質和濃度的質控樣品，對快速檢測產品性能指標和快速檢測整體過程進行質量控制。本研究從日常快速檢測和實驗室檢測的不同需求出發，最終設置0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個添加量，提供一種雞蛋中氟苯尼考質控樣品研制方法，彌補有證的基體標準物質卻可選項目少、濃度水平單一、采購成本高、定制周期長等問題，同時探究影響氟苯尼考質控樣品穩定性的因素，自主研制均穩性良好的質控樣品可推廣應用于快速檢測及實驗室檢測等不同領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋 市購；氟苯尼考標準物質（99.82%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；正己烷、丙酮（均為分析純）廣州化學試劑廠；正丙醇（分析純） 天津市永大化學試劑有限公司 ；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

T Q-S 超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀美國Waters公司；GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司；Scientz 50F/A真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；EFAA-HM-01多孔渦旋振蕩器 上海ANPEL科技股份有限公司；Multifuge X3R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；RV10旋轉蒸發儀 德國IKA公司；HBE-12B固相萃取裝置 天津市恒奧科技發展有限公司；Milli-Q 超純水制備儀德國Merck公司；國產標準試驗篩（40 目）。

1.3 方法

1.3.1 基質的選擇與準備

采用GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》[21]對樣品中氟苯尼考的含量進行檢測，檢測結果數值低于方法檢出限，則選擇作為制備質控樣品的空白基質。

1.3.2 方法回收率

為確保儀器檢測質控樣品均勻性和穩定性結果的科學性，在開展質控樣品制備之前先驗證雞蛋中氟苯尼考添加回收率[22-23]。選取不含氟苯尼考的雞蛋為空白基質，預處理勻漿后制成雞蛋液，根據快檢產品及快檢方法評價技術規范相關要求質控樣品以1～2 倍氟苯尼考快檢方法或產品檢出限為典型含量水平，同時為更好應用于實驗室氟苯尼考檢測的質量控制，質控樣品充分考慮滿足不同檢測方法的雞蛋氟苯尼考檢出限范圍為0.1～1.0 μg/kg，氟苯尼考標準物質的添加量為0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平，采用GB/T 22338—2008的方法檢測其含量，并計算回收率。

1.3.3 質控樣品的制備

以不含氟苯尼考的雞蛋液為空白基質，添加一定的氟苯尼考標準物質，添加量為0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平，4 000 r/min均質混勻2 min（采用20 s間歇式攪拌，攪拌6 次）制備成氟苯尼考陽性新鮮質控樣品（非凍干組），將新鮮質控樣品經過24 h冷凍干澡、2 次混勻（4 000 r/min均質混勻2 min）、過40 目試樣篩及分裝等步驟，制備成氟苯尼考陽性凍干質控樣品（凍干組），具體制備流程如圖1所示。

圖1 雞蛋中氟苯尼考質控樣品的制備流程Fig.1 Preparation process of quality control samples for determination of florfenicol in eggs

1.3.4 質控樣品中氟苯尼考的檢測

準確稱取一定量的新鮮陽性質控樣品或凍干陽性質控樣品（其中凍干樣品按照1∶4比例加蒸餾水復溶，渦漩混勻恢復至蛋液狀態），采用GB/T 22338—2008方法進行測定，凍干樣品結果以復溶后樣品質量計算，保留小數點后兩位。

液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（180 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min，90% A、10% B；1.0～3.5 min，90%～10% A、10%～90% B；3.5～4.5 min，10% A、90% B；4.5～4.6 min，10%～90% A、90%～10% B；4.6～6.0 min，90% A、10% B。流速0.35 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積1 μL。

質譜條件：電噴霧離子源；負離子模式；多反應監測模式；電噴霧電壓3.5 kV；離子源溫度500 ℃；碰撞氣為氬氣；干燥氣為氮氣；流量1 000 L/h。質譜參數見表1。

表1 氟苯尼考的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for determination of folrfenicol

1.3.5 質控樣品的均勻性評估

依據CNAS-GL003:2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》[24]和RB/T 031—2020《能力驗證計劃的選擇與核查及結果利用指南》[25]要求，隨機稱取上述凍干組（固態）和非凍干組（液態）氟苯尼考質控樣品各10 份（n=10），每份樣品重復測定2 次，并采用單因子方差分析法計算F值，進行均勻性評估分析。若計算得到的方差分析F＜F0.05（9,10），則判定樣品均勻性良好。

1.3.6 質控樣品的穩定性

1.3.6.1 短期穩定性

參照CNAS-GL003:2018，每隔1 個月隨機抽取6 個樣品（n=6），采用獨立樣本t檢驗法，與均勻性檢驗數據的初始值進行比較分析，從而監測不同制備方式、貯存溫度、加標量條件下樣品中氟苯尼考含量變化，考察各條件對短期穩定性的影響。

將上述凍干組和非凍干組質控樣品置于－18 ℃貯存，考察不同樣品狀態對質控樣品穩定性的影響。

將凍干組質控樣品分別置于25、4、－18 ℃貯存，考察不同貯存溫度對凍干質控樣品穩定性的影響。

將3 個添加量的凍干組質控樣品置于－18 ℃貯存，考察不同加標量對凍干質控樣品穩定性的影響。

1.3.6.2 長期穩定性

長期穩定性研究12 個月，每隔3 個月時間隨機抽取6 個樣品，平行測定2 次取平均值，采用t檢驗法對數據進行統計分析。

1.3.7 質控樣品的定值

參照CNAS-CL04:2007《標準物質標準樣品生產者能力認可準則》[26]和JJF 1343—2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》[27]。本研究選取凍干質控樣品為例，采用6 家中國合格評定國家認可委員會認可的實驗室進行聯合定值的方式，給每個實驗室發放3 份質控樣品，每個樣品測定2 次平行，采用實驗室認可的國家標準檢測方法分別測定氟苯尼考含量，通過吉布斯G檢驗和科克倫C檢驗判定檢測結果無異常值后，最終將測定的總平均值作為質控樣品的參考值。

2 結果與分析

2.1 添加回收率結果

選取經GB/T 22338—2008方法確證不含有氟苯尼考的雞蛋作為空白基質，分別添加0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg三個水平的目標物，驗證雞蛋中氟苯尼考回收率。經儀器測定結果表明本方法添加氟苯尼考回收率在85.8%～113.7%之間（表2），符合GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》[28]方法回收率偏差范圍相關要求，表明儀器檢測方法準確、可靠。

表2 雞蛋中氟苯尼考回收率Table 2 Recoveries of florfenicol spiked in eggs

2.2 氟苯尼考質控樣品的均勻性

采用GB/T 22338—2008方法分別測定非凍干組（A）和凍干組（B）質控樣品3 個添加量的氟苯尼考含量，測量結果采用單因子方差統計分析法（F檢驗）分析處理，SPSS軟件分析實驗結果的F值，結果見表3和表4。

表3 非凍干組（A）質控樣品均勻性檢驗結果Table 3 Results of homogeneity test for non-lyophilized samples (A)

續表3

表4 非凍干組（B）質控樣品均勻性檢驗結果Table 4 Results of homogeneity test for non-lyophilize samples (B)

實驗測試的組內自由度為10，組間自由度為9，經統計分析，非凍干組（A）3 個水平的F值在2.562～2.914之間，凍干組（B）3 個添加量的F值在1.970～2.804之間，均小于臨界值F0.05（9,10）=3.020，P值均大于0.05，表明在顯著水平α=0.05時，添加同一添加量的樣品之間不存在顯著性差異，添加的氟苯尼考標準物質在雞蛋基質中均勻分散，均勻性驗證方差分析結果見表5。

表5 均勻性驗證方差分析結果Table 5 Results of variance analysis

2.3 氟苯尼考質控樣品的穩定性

2.3.1 短期穩定性

2.3.1.1 樣品狀態對質控樣品穩定性的影響

制備分裝完成的非凍干組（液態）和凍干組（固態）質控樣品分別置于－18 ℃貯存，每隔1 周檢測1 次，每組測定6 個樣品，檢測平均值即為質控樣品氟苯尼考含量，監測3 個月內2 組質控樣品目標物含量變化。從圖2可以看出，凍干質控樣品較非凍干質控樣品含量變化趨勢更平緩。按CNAS-GL003:2018穩定性檢驗要求，將每次檢測平均值與初始檢測平均值進行一致性比較，計算t值，其中凍干質控樣品第1個月至第3個月的t值在0.802～1.641之間，均小于t臨界值（2.145）。非凍干質控樣品第1個月至第3個月的t值在2.786～7.472之間，第3個月t值大于t臨界值（2.145）。結果表明凍干質控樣品較非凍干質控樣品在－18 ℃條件貯存3 個月的短期穩定性更高。

圖2 樣品狀態對質控樣品穩定性的影響Fig.2 Impact of sample state on the stability of quality control samples

凍干質控樣品基本不含水分，在－18 ℃貯存條件下雞蛋的蛋白質不易發生不可逆變性，因此其抗凍性和穩定性較強。目前已有相關研究表明雞蛋主要成分卵白蛋白經過冷凍干燥后，結構上并未發生斷裂和重組，并且化學性質均未發生明顯變化，說明冷凍干燥處理不會對雞蛋中蛋白質產生較大影響[29-30]。與凍干組相比，非凍干組樣品在冷凍過程中容易產生蛋白質變性，使與蛋白質結合的氟苯尼考狀態受到一定程度的影響，此外蛋白質不可逆變性產生的絮狀物分層也影響了樣品基質的分散性和穩定性，從而導致非凍干組質控樣品穩定性降低。綜上，分析原因可能是凍干組樣品抗凍能力強，蛋白質不易變性使其具有更高的穩定性。

2.3.1.2 貯存溫度對質控樣品穩定性的影響

凍干質控樣品不容易變質，可以在不同條件下貯存，日常檢驗工作應用也更為廣泛，因此本研究以凍干質控樣品為對象，探究溫度條件對質控樣品穩定性的影響。將制備分裝完成的凍干質控樣品分組放置于25、4、－18 ℃貯存，監測3 個月內不同溫度貯存的質控樣品目標物含量變化，由圖3可以看出，－18 ℃組質控樣品氟苯尼考含量變化趨于平緩，25 ℃組和4 ℃組質控樣品氟苯尼考含量在第3個月有明顯下降。

圖3 不同貯存溫度對質控樣品穩定性的影響Fig.3 Impact of storage temperature on the stability of quality control samples

經t檢驗，凍干質控樣品在－1 8 ℃條件貯存1～3 個月的t值范圍在0.802～1.641之間，均小于t臨界值（2.145）。在25 ℃條件下貯存1～3 個月的t值在0.458～8.501之間，第3個月t值為8.501，大于t臨界值（2.145）。在4 ℃條件下貯存1～3 個月的t值在1.053～4.845之間，其中第3個月t值為4.845，大于t臨界值（2.145）。上述結果表明質控樣品在－18 ℃條件下貯存3 個月的短期穩定性良好，且較4 ℃和25 ℃條件貯存更為穩定。分析原因可能是受微生物繁殖的影響，由于質控樣品制備過程未進行滅菌處理，樣品存在有一定基數的微生物，其中雞蛋中主要的微生物種群為沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等，其最適生長溫度在20～40 ℃之間，在25 ℃（常溫）條件貯存微生物生長繁殖最快，所以添加的抗生素在微生物作用下迅速降解。而貯存溫度降低則會明顯減緩微生物的生長繁殖，從而降低氟苯尼考的消耗和降解速率，故在－18 ℃（冷凍）條件下貯存的質控樣品氟苯尼考含量變化趨勢平緩。目前已有研究表明微生物對氟苯尼考等抗生素的降解起主導作用[31-32]，這說明貯存溫度對氟苯尼考質控樣品穩定性的影響可能主要來自對微生物繁殖的影響。

2.3.1.3 加標量水平對質控樣品穩定性的影響

將不同添加量的凍干質控樣品置于－18 ℃貯存，監測3 個月內不同添加量的質控樣品氟苯尼考含量變化，由圖4可以看出不同添加量（0.25、0.4 μg/kg和2.0 μg/kg）的質控樣品目標物含量變化趨勢均較為平緩。經t檢驗，0.25 μg/kg的質控樣品穩定性檢驗t值在0.684～1.932之間，0.4 μg/kg的t值在0.437～1.689之間，2.0 μg/kg的t值在0.802～1.641之間，均小于t臨界值（2.145）。上述結果表明不同濃度質控樣品在－18 ℃條件下貯存3 個月的短期穩定性良好。

2.3.2 長期穩定性

將不同含量分裝好的凍干質控樣品貯存于－18 ℃，放置12 個月，期間每間隔3 個月隨機抽取6 份進行測定，監測該質控樣品長期穩定性，所有t值均小于t臨界值（2.145），結果見表6。結果表明不同添加量的質控樣品在12 個月存儲期間，穩定性良好。

表6 質控樣品的長期穩定性測定結果Table 6 Results of long-term stability test for quality control samples

2.4 質控樣品的定值

本研究按照自主研制3 個添加量的氟苯尼考質控樣品，經均勻性和穩定性驗證結果滿足CNAS-GL003:2018相關要求，以凍干質控樣品（固態）為例，選取6 家CNAS認證的實驗室，采用GB/T 22338—2008標準方法檢測凍干質控樣品目標物含量，分別匯總各組參加合作定值數據，結果見表7。

表7 質控樣品的定值數據及結果Table 7 Analytical results for certification of quality control samples

通過吉布斯檢驗，發現所有實驗數據G值均不大于G0.05臨界值（查表得1.89），表明數據不存在異常值，再通過用科克倫檢驗確定6 個實驗室對不同添加量質控樣品的檢測數據C值不大于C0.05（6,6）臨界值（查表得0.445），表明沒有隨機誤差太大的實驗室，各實驗室間的測量屬于等精度測量，因此將所有實驗室每個添加量質控樣品的總平均值作為氟苯尼考標準樣品含量定值結果：X1=0.23 μg/kg，X2=0.39 μg/kg，X3=1.92 μg/kg，3 個添加量的質控樣品可應用于快速檢測或實驗室檢測的質量控制及能力驗證等領域。

3 結論

采用雞蛋基質分別添加標準溶液的方式成功研制了3 個添加量的液態質控樣品，另外將液態樣品采用真空冷凍干燥的方式，制得固態凍干粉，2 種狀態質控樣品均勻性均較良好。通過考察3 個月短期穩定性，結果發現不同樣品狀態、不同貯存溫度對質控樣品穩定性有影響，不同的添加量則對質控樣品穩定性無影響。該方法制備的凍干質控樣品比非凍干質控樣品穩定性更高，分析原因可能是凍干組抗凍性能更好，蛋白質不易變性使其具有更高的穩定性。為了保證質控樣品穩定性，建議采用冷凍干燥方式去除水分。凍干質控樣品在冷凍（－18 ℃）貯存12 個月穩定性良好，但在冷藏（4 ℃）和常溫（25 ℃）貯存3 個月穩定性有所下降，可能是受微生物繁殖的影響，貯存溫度降低會明顯減緩微生物的生長繁殖，從而降低氟苯尼考的消耗和降解速率。本研究制備的凍干質控樣品不易變質，冷凍條件下可穩定保存12 個月，可應用于實驗室日常檢測作為質量控制手段，并推廣應用于快檢產品評價、快檢機構考核、快檢方法研制等快檢各個領域。