基于乳清蛋白的駱駝乳中摻假牛乳的檢測及熱處理對方法的影響

李玲玉，王 俊，李敏婧，楊迎春，苗 靜，趙仲凱，楊 潔

（新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046）

新疆作為我國畜牧大省（區），在雙峰駝數量以及駝乳產量上占據優勢地位[1]。近年來，隨著乳制品工業的快速發展、乳品科學技術的不斷進步，國內外學者對駝乳營養價值、生理功能等的研究日益深入，使得駝乳在疾病輔助治療、營養保健、食品加工應用中擁有巨大的潛力[2-5]，其經濟價值遠高于牛乳（牛乳：7 元/kg；雙峰駝乳：50～80 元/kg）。但由于雙峰駝乳產量遠低于牛乳，乳供應量明顯受季節性波動的影響[6]，且奶源質量難以控制[7]，這使得駝乳及其制品成為蓄意摻假的目標，受經濟利益驅動的摻假現象時常發生[8]；向高價值的駝乳中摻入低值的牛乳是最常見且最容易實現的摻假行為，這種摻假行為除了造成消費者的經濟損失外，還可能對個人健康造成不良后果，特別是對牛乳過敏的人群[9]。

而目前國內對于雙峰駝乳及乳制品的摻假檢測并沒有明確標準[7]，市場監管缺乏可依靠的標準及檢測方法。此外，國內外關于雙峰駝乳的摻假檢測相關報道較少，而對水牛乳、羊乳及乳制品摻假辨別技術的研究比較深入[10-11]。因此，迫切需要針對新疆雙峰駝乳及乳制品摻假問題，建立篩查、分析檢測方法以及相應的標準，維護廣大消費者的利益。

常用的乳源畜種的辨別技術可以根據DNA序列和乳蛋白分為兩類。物種特異性DNA序列已廣泛應用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測，它可以識別不同畜種的動物乳來源，從而辨別乳的摻假[12-14]，但PCR方法的DNA分離程序較為繁瑣，且通常不產生定量信息。與基于DNA序列分析的方法相比，基于蛋白質的方法主要關注乳的蛋白質差異，相比之下更為實用，常見的技術方法有毛細管電泳法[15]、雙向電泳法[10,16]、酶聯免疫吸附法[17-18]和液相色譜法[19]。

基于蛋白質的檢測方法中，液相色譜法因具有簡單的樣本制備、有效的分離和定量以及高的靈敏度和選擇性的特點，被廣泛地應用于乳及乳制品的摻假檢測當中。近年來，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和超高液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法已經成功應用到摻假的水牛乳、山羊乳或綿羊乳及其制品的檢測，蛋白標識物主要分為乳清蛋白和酪蛋白[19-20]。乳清蛋白標識物以β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）和α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）為主，酪蛋白標識物主要有κ-酪蛋白和αs1-酪蛋白。如Ke Xing等[21]建立了一種UPLC-串聯質譜方法，通過檢測特征蛋白肽同時定量4 種酪蛋白和兩種主要的乳清蛋白，這些肽能夠作為標識物用于定量分析山羊乳或綿羊乳制品中摻假的牛乳。然而目前報道中鮮見使用UPLC法，以牛乳清蛋白為摻假標識物，檢測新疆雙峰駝乳及其制品中摻假的牛乳。本實驗室在前期研究工作中發現，駝乳乳清蛋白的組成與牛乳相比有較明顯的差異[22]；此外，有大量研究表明：駝乳乳清蛋白中含有極少量或不含有β-Lg[16,23-24]，因此牛β-Lg可作為一種潛在的標識物用于駝乳中牛乳摻假的檢測。

本研究基于UPLC技術手段，以牛β-Lg為摻假標識物，通過評估牛β-Lg的水平定性、定量檢測駝乳中摻假的牛乳。此外，通過已建立的UPLC方法對10種隨機購買的市售純駝乳粉進行檢測，以評估目前國內市場上純駝乳粉的摻假情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮駝乳采集自烏魯木齊市紅雁池，鮮牛乳采集自昌吉吉木薩爾，10 種市售全脂純駝乳粉購買自當地市場及電商平臺，純牛乳粉和純駝乳粉樣品由廠家提供。

牛β-Lg標準品（純度≥90%）、牛α-La標準品（純度≥85%）、牛血清白蛋白標準品（純度≥98%）、牛乳鐵蛋白標準品（純度≥85%）和乙腈（HPLC級） Sigma上海儀器公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，分析純） 成都市科隆化學品有限公司；冰乙酸（分析純） 天津市鑫鉑特化工有限公司；實驗過程中均使用超純水。由于缺乏駱駝乳蛋白的商業標準品，本研究所用駝α-La是由本實驗室制備，通過質譜鑒定為alpha-lactalbumin（Camelus bactrianus），登錄號為XP_010962515.1。

1.2 儀器與設備

AcquityTMUPLC儀（配有光電二極管陣列檢測器和Waters Empower 3色譜工作站） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：BEH300 C4柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.1% TFA溶液，B為0.1% TFA的乙腈溶液；洗脫梯度：0～2.08 min，75%～68% A、25%～32% B；2.08～8.34 min，68%～48% A、32%～52% B；8.34～10.42 min，42%～75% A、52%～25% B；10.42～11 min，75% A、25% B。流速0.2 mL/min，檢測波長214 nm，進樣體積5 μL，柱溫30 ℃，樣品溫度25 ℃。

1.3.2 樣本制備及處理

取鮮牛乳按體積分數100%、80%、60%、50%、35%、25%、20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%比例摻入到鮮駝乳中制備摻假樣本（3 個重復）；取牛乳粉按質量分數100%、80%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%比例摻入到純駝乳粉中，制備摻假樣本（3 個重復），然后按1∶10的比例，將10 g粉樣溶于100 mL超純水中；熱加工處理鮮乳樣條件如表1所示。

表1 乳樣本的熱處理條件Table 1 Heat treatment conditions for milk samples

參考Manzo等[19]的乳樣前處理方法并稍作改動，去除乳樣中的乳脂和酪蛋白。取25 mL乳樣經4 ℃、8 000 r/min離心15 min去除乳脂；將清液收集到燒杯中，向脂肪層和沉淀酪蛋白層加入5 mL水，渦旋3 次，使殘留在脂肪層和酪蛋白層的乳清蛋白洗出，將洗液一并倒入燒杯；用冰乙酸調pH 4.6，40 ℃水浴20 min，經4 ℃、8 000 r/min離心15 min，除去酪蛋白；將清液收集到燒杯中，向沉淀酪蛋白層加入10 mL水，渦旋3 次，使殘留在酪蛋白層的乳清蛋白洗出，將洗液一并倒入燒杯中；最后將乳清蛋白清液用水洗入50 mL容量瓶并定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾，用于液相色譜分析。

1.3.3 蛋白標準品標準曲線的繪制

取牛β-Lg標準品，用超純水將標準品配成1 000 mg/L的母液，后依次稀釋成質量濃度為500、200、100、50、25 mg/L的標準系列溶液，進行液相色譜分析。以牛β-Lg標準品質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制牛β-Lg的標準曲線。

1.3.4 摻假乳樣本摻假標準曲線的繪制

通過測量一系列摻假樣本中牛β-Lg的峰面積，與添加的牛乳或牛乳粉的比例構建摻假標準曲線，摻假樣本的標準曲線以摻入牛乳或牛乳粉的百分比為橫坐標，以摻假標識物牛β-Lg的峰面積（3 個平行測量的平均值）為縱坐標繪制。

1.4 數據統計及圖表繪制

使用Microsoft Excel 2013（Microsoft Corporation，Redmond，WA，USA）進行數據統計分析和表格繪制，使用Origin 8.5軟件（OriginLab，Northampton，MA，USA）進行數據回歸分析和繪制蛋白色譜瀑布圖。

2 結果與分析

2.1 乳清蛋白的分離鑒定

采用外標法，所建立的摻假檢測分析方法可以有效的分離和鑒定駝乳和牛乳中的乳清蛋白。含有駝α-La、牛α-La和牛β-Lg的混合標準品溶液在色譜柱梯度洗脫程序中運行11 min，3 種乳清蛋白組分在9 min內實現了有效分離（圖1A）；由圖1A可知，駝α-La的保留時間為6.6 min，牛α-La的保留時間為7.2 min，牛β-Lg的保留時間為8.4 min；圖1B為3 種蛋白混合標準品的三維色譜圖。

駝α-La由123 個氨基酸組成，其中第39個氨基酸與牛α-La的對應氨基酸不同[25]，根據氨基酸序列比對，這兩個蛋白之間的相似性和同一性分別為82.9%和69.1%[26]；此外，駝α-La的分子質量為14.43 kDa，而牛α-La的分子質量為14.18 kDa[27]，因此，這兩種蛋白質具有不同的保留時間。

由鮮駝乳乳清蛋白的色譜圖（圖1C藍色線）可以看出，在該摻假檢測分析方法下，鮮駝乳乳清蛋白譜圖只有一個主峰（b1），該峰保留時間在6.649 min，根據標準品色譜圖比對，可以確定該蛋白為駝α-La。與鮮駝乳乳清蛋白不同，鮮牛乳乳清蛋白（圖1C紅色線）在保留時間7.280 min和8.417 min（a1）處出現了兩個主峰，根據峰保留時間和牛β-Lg標準品色譜峰鋒形，可以確定蛋白a1為牛β-Lg。鮮牛乳和鮮駝乳乳清蛋白譜圖重疊時，可以清晰地識別出牛β-Lg（圖1C），駝乳中不含有β-Lg；同時，在分析鮮駝乳和鮮牛乳各占50%（體積分數）的摻假乳樣本時，可以確定牛β-Lg很容易被識別出（圖1D）。因此，所建立的以牛β-Lg為摻假標識物的UPLC方法，可用于駝乳中摻假牛乳的檢測。顯示峰純度的三維色譜圖：鮮駝乳和鮮牛乳各50%摻假乳樣本的三維色譜圖如圖2所示。

圖1 單獨標準品、混合標準品及摻假樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of individual and mixed standards of camel α-La,bovine α-La and bovine β-La and adulterated samples

圖2 鮮駝乳和鮮牛乳各50%摻假乳樣本的三維色譜圖Fig.2 3D chromatograms of raw camel milk and milk powder adulterated with 50% cow milk

2.2 摻假標識物牛β-Lg受熱處理的影響

根據表1，將同一批采集的新鮮牛乳分成5 組，其中3 組按不同熱處理條件處理：巴氏殺菌乳、高溫滅菌乳和超高溫滅菌乳，1 組新鮮乳樣不經任何熱處理作為對照，另外1 組新鮮乳樣不經任何處理直接凍干作為奶粉的對照（涉及復溶使蛋白溶度不一致的問題）。

由圖3可知，巴氏殺菌條件下，摻假標識物牛β-Lg受熱處理的影響較小，而高溫滅菌條件以及超高溫滅菌條件影響均較大。與鮮乳相比，不經任何處理直接凍干的乳粉按1∶10比例復溶后，乳液中的β-Lg含量有所下降；而噴霧干燥乳粉與凍干乳粉相比，β-Lg的損失較大，這可能是乳粉制作過程中蛋白質的降解所致[28]。結果表明：巴氏殺菌乳受熱處理影響較小，不影響β-Lg作為摻假標識物進行檢測；乳粉樣本雖受熱處理的影響較大，但不影響β-Lg作為摻假標識物進行檢測；因此，該摻假檢測方法，以牛β-Lg為摻假標識物，可以應用于鮮駝乳、巴氏殺菌駝乳以及駝乳粉的摻假定性檢測。

圖3 不同熱處理方式下牛乳乳清蛋白譜圖Fig.3 Chromatograms of cow milk whey protein under different heat treatments

2.3 摻假標準曲線的繪制

將同一批采集的新鮮乳樣，按照1.3.2節樣本的制備配成一系列駝乳摻假樣本后，分為2 組：鮮乳組和巴氏殺菌乳組3 個重復；純駝乳粉和純牛乳粉樣本同樣按照1.3.2節樣本的制備配成一系列駝乳粉摻假樣本3 個重復；按照1.3.1節的色譜條件進行3 種類型摻假乳樣標準曲線的繪制。

3 種類型一系列摻假乳樣本的色譜圖如圖4所示，牛β-Lg的峰強度均隨著牛乳或牛乳粉添加比例的增加而增加，同時牛β-Lg峰面積的增加與牛乳或牛乳粉添加比例的增加呈正相關，說明該方法能較好地檢測駝乳中摻假牛乳的百分比。駝鮮乳摻入牛乳的標準曲線，其回歸方程為y=277 219.32x－128 496.92，R2=0.997 9；巴氏殺菌駝乳摻入牛乳的標準曲線，其回歸方程為y=267 597.11x－647 839.84，R2=0.996 9；駝乳粉摻入牛乳粉的標準曲線，其回歸方程為y=101 795.61x－363 117.54，R2=0.997 8；結果表明：3 種類型摻假乳樣本標準曲線的線性良好，線性相關系數（R2）分別為0.997 9、0.996 9和0.997 8，均在0.99左右，可用于駝乳中摻假牛乳的定量檢測。

圖4 鮮駝乳摻牛乳（A）、巴氏殺菌駝乳摻牛乳（B）、駝乳粉摻牛乳粉（C）的蛋白色譜瀑布圖Fig.4 Waterfall chromatograms of proteins in raw camel milk adulterated with cow milk (A),pasteurized camel milk adulterated with cow milk (B) and camel milk powder adulterated with cow milk powder (C)

通過檢測牛β-Lg的峰面積，定量評價駝乳中摻假牛乳的百分比，該分析方法最低可檢測至鮮駝乳摻假牛乳2%（V牛乳/V駝乳）、巴氏殺菌駝乳摻假牛乳3%（V牛乳/V駝乳）、駝乳粉摻假牛乳粉5%（m牛乳粉/m駝乳粉），檢出限依據信噪比RSN=3確定，從成本和風險的角度來看，摻假比例低于5%屬于無意污染[29]，因此該方法可滿足實際應用的要求。以β-Lg標準品的標準曲線計算得，鮮駝乳摻假檢出限為β-Lg 107.448 mg/L、巴氏殺菌駝乳摻假檢出限為β-Lg 103.648 mg/L、駝乳粉摻假檢出限為β-Lg 77.947 mg/100 g。摻假檢測定量限為鮮駝乳摻假牛乳5%（V牛乳/V駝乳）β-Lg 181.324 mg/L、巴氏殺菌駝乳摻假牛乳5%（V牛乳/V駝乳）β-Lg 149.628 mg/L、駝乳粉 摻假牛乳粉1 0 %（m牛乳粉/m駝乳粉），β-Lg 105.246 mg/100 g，定量限依據信噪比RSN=10確定。

此外，建立良好的摻假定量方程時，存在乳中蛋白質濃度的不確定性問題[11]，如摻假標識物牛β-Lg在牛乳中的濃度受多種因素（品種、季節、地區、泌乳期等）的影響[24]，具有不可控和不確定性；此外，乳粉的加工工藝條件不盡相同，會導致不同程度的蛋白質損失，也使得乳中蛋白質濃度存在不確定性[28,30]。但是，蛋白質濃度的不確定性現實存在并且不可避免，對于任何摻假標識物和任何摻假定量檢測方法均是如此，因此，定量方程必須假設相同的牛β-Lg濃度，計算出的摻假水平只能視為近似估計。

2.4 方法學評價結果

2.4.1 分離選擇性

由于樣本前處理準備過程中沒有選擇性的只提純牛β-Lg（除脂后僅酸沉淀去除酪蛋白），所以獲得的乳清清液里包含其他乳清蛋白，并且可能在214 nm處對目標蛋白（β-Lg）檢測的存在干擾。因此，根據Boitz等[31]的方法，為驗證該方法的分離選擇性，使用所建立的UPLC方法對另外的主要牛乳清蛋白（牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和乳白蛋白）進行分析。混合標準品溶液的色譜圖見圖5，4 種牛乳請蛋白在9 min內實現有效分離，且駝α-La與牛α-La和牛β-Lg也實現了很好地分離（圖1a），結果表明牛乳和駝乳乳清中主要其他乳清蛋白對牛β-Lg標識物的檢測不會造成干擾。

圖5 牛乳清蛋白標準品的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatograms of bovine whey protein standards

2.4.2 線性范圍

通過制備一系列質量濃度的牛β-Lg標準溶液，評估該方法下牛β-Lg線性質量濃度范圍。以6 個數據點（3 次進樣的平均值）建立牛β-Lg標準曲線，結果表明β-Lg在25～1 000 mg/L范圍內線性良好，線性回歸方程為y=18 996.40x－386 292.29，R2=0.999 9。

2.4.3 精密度

以低、中、高3 個水平摻假駝奶粉（30%、50%、80%）為樣本，通過比較牛β-Lg峰面積的值，評價該方法的日內（同一樣本1 d內進樣6 次）和日間（同一樣本連續進樣3 d）的精密度[32]。3 個摻假駝奶粉樣本日內精密度的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.45%、0.23%和0.10%，日間精密度RSD分別為7.18%、1.64%和1.26%。結果表明，所建立的摻假檢測方法具有良好的精密度，包含儀器的精密度和供試樣本的穩定性。

2.4.4 重復性和回收率

通過對純牛奶粉和純駝奶粉各進行5 次獨立前處理樣品檢驗，通過比較牛β-Lg、駝α-La峰面積值，驗證樣品制備過程以及取樣的重復性，純牛奶粉和純駝奶粉RSD分別為2.77%和1.44%。以上結果表明，該方法的重復性好（RSD≤5%）。

為測試檢測方法的回收率，向經過重復性檢驗的純牛奶粉樣品（β-Lg質量濃度均值為126.95 mg/L）中加入牛β-Lg標準品，加入標準品的質量濃度分別為61.80、122.40 mg/L和204.00 mg/L，各3 個重復；向經過重復性檢驗的駝奶粉樣本（β-Lg含量為0.00 mg/L）中加入牛β-Lg標準品，加入標準品的質量濃度為61.92、103.20 mg/L和165.12 mg/L，各3 個重復；按照與樣本相同的前處理方法以及色譜條件進行測試，用牛β-Lg標準品的線性標準曲線計算牛β-Lg的質量濃度。該方法的加標回收率為94.76%～105.18%，RSD為0.48%～4.20%，結果表明方法回收率較好（表2）。

表2 方法的回收率Table 2 Spiked recovery of the developed method

2.5 市售駝乳粉樣本檢測

從當地市場和電商平臺隨機購買了10 種市售純駝乳粉樣本，將這些樣本按照1.3.2節前處理方法以及1.3.1節色譜條件進行檢測，各3 個重復。根據牛β-Lg標準曲線y=18 996.40x－386 292.29，可以計算得出市售純駝乳粉樣本中牛β-Lg含量；此外，根據建立的“理想化”駝乳粉摻假牛乳粉標準曲線可計算得到駝乳粉摻假牛乳的大致估計比例，純駝乳粉摻假情況如表3所示。在10 種全脂純駝乳粉樣本中，未檢測到牛β-Lg的有6 種，表明這6 種駝乳粉沒有摻入牛乳；有4 種檢測到了牛β-Lg，表明這4 種駝乳粉中摻入了牛乳，該檢測結果與本實驗室以前建立的PCR方法檢測結果一致[12]，這排除了檢測結果的假陽性和假陰性。結果表明，該方法可成功應用于市售駝乳粉中摻假牛乳的篩查、檢測。市售純駝乳粉樣本CMP1-2和CMP1-3的色譜圖見圖6。

表3 10 種市售純駝乳粉樣本摻假檢測結果Table 3 Results obtained for detection of adulteration in 10 different camel milk powder products

圖6 市售駝乳粉樣本色譜圖Fig.6 Chromatograms of commercial camel milk powder samples

3 結論

基于乳清蛋白以牛β-Lg為摻假標識物，建立了定性定量檢測駝乳中摻假牛乳的UPLC方法，并且探究熱加工處理對摻假標識物的影響，結果表明該檢測方法可應用于鮮駝乳、巴氏殺菌駝乳以及駝乳粉中摻假牛乳的檢測。此外，利用該方法對10 種市售駝乳粉樣本進行了檢測，其中4 個樣本檢出了摻假牛乳，由檢測結果可知，目前國內市場上存在駝乳粉摻假現象，建立摻假檢測方法及相應標準勢在必行。

無論使用哪種標識物（蛋白或DNA），進行乳的摻假水平定量時，都必須在不考慮標識物含量變化的前提下進行定量，這表示計算得出的摻假水平只能視為一種近似度量，但實際上對摻假水平進行精確定量的問題可以忽略不計，因為如果發生受經濟利益驅動的摻假行為，必將以大量的水平存在（5%以及更多），較低的摻假百分比不會產生期望的經濟意義[11,29]，因此，考慮到實際情況，定量過程中的不精確性可以容忍。

此外，乳清蛋白的穩定性受到熱處理強度的影響，使得該方法存在一定的局限性，因此需要繼續探究熱穩定性標識物，為今后駝乳摻假檢測標準技術規程的建立提供實驗依據。本實驗室目前正在尋找熱穩定性標識物，發現乳中的酪蛋白熱穩定性非常好[33]，并且牛乳的酪蛋白與駝乳相比存在差異，基于UPLC技術手段，有望實現全面檢測駝乳及其乳制品中摻假的牛乳。