不同泌乳期羊乳和牛乳的高通量定量乳清蛋白質組學

張 榮，吳欣雨，賈 瑋

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

隨著乳制品市場多樣化和家庭膳食結構的改善，全球羊乳消費保持穩定增長，促進了人們對羊乳營養特性的探索。羊乳及其制品富含維生素、礦物質、高質量蛋白質、低膽固醇和較小的脂肪分子等營養素，被認為是一種易于消化的低致敏性天然營養源，是牛乳基嬰幼兒配方乳粉和母乳的潛在乳源替代物。

羊乳乳清因含有高營養價值蛋白質、大量低聚糖、乳糖和礦物質被認為是功能性成分，具有免疫調節功能和抗菌活性，并可延緩心血管疾病、骨質疏松癥、癌癥和肥胖癥的發病或改善其狀況。目前，基于乳清蛋白的配方乳粉可替代普通嬰幼兒配方乳粉，避免嬰幼兒對全脂牛乳或大豆蛋白的胃腸道不耐受。Sousa等發現，與其他反芻動物乳相比，羊乳中的低聚糖與母乳更相似，可作為一種重要營養素添加至牛乳配方中，以達到抗致病性、抗黏附性和益生元作用。De Souza Araújo等研究表明，羊乳乳清能抑制促炎細胞因子的合成，具有顯著抗炎作用。同時，母乳為嬰幼兒時期的最佳營養來源，但目前由于女性健康和工作等原因導致母乳喂養率較低。羊乳和牛乳中蛋白質作為嬰幼兒生長發育的必要物質基礎和母乳替代品中的重要營養素，目前對其初乳階段蛋白質分析較少，缺少不同階段羊乳和牛乳基乳粉的蛋白質精確配比信息。

蛋白質組學分析因其具有鑒別和量化數千種蛋白質的能力，已廣泛應用于食品營養特性的深入研究。有研究利用同位素標記相對和絕對定量蛋白質組學技術對牛初乳和牛常乳的乳清蛋白進行差異分析，發現與信號傳導相關的9 種差異蛋白。曹雪妍等在牛初乳和牛常乳乳清中鑒定出129 種糖蛋白和190 個差異表達糖基化位點，參與了補體與凝血級聯、金黃色葡萄球菌感染和溶酶體等通路。在關中山羊和荷斯坦奶牛的乳清蛋白中鑒定出114 種顯著差異表達蛋白，主要參與補體和凝血級聯反應。這些結果豐富了牛乳和羊乳的乳清蛋白生物學特性信息，但鮮有用于區分羊乳和牛乳之間差異的分析流程，在小樣本快速、可重復和高靈敏分析的情況下基于蛋白質組學分析乳清蛋白差異的方法更少。

為更好地了解羊乳與牛乳的乳清蛋白組成并評價其差異，本研究對羊乳和牛乳在不同泌乳期的乳清蛋白組成進行比較分析。采用非標記定量（lable free quantitative method，LFQ）蛋白質組學方法，基于成本效益和時間最大值算法，系統研究不同泌乳期羊乳和牛乳乳清蛋白質組的組成和變化。利用生物信息學分析進行基因功能注釋和參與通路分析，用于評估乳清蛋白質潛在的生物活性功能差異，以期更好地了解牛乳和羊乳的蛋白質組成差異，為羊乳基乳制品的研發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊乳和牛乳樣品取自陜西省西安市關中奶山羊和荷斯坦奶牛養殖場。采集產后0～5 d羊初乳和牛初乳和產后1～6 個月的羊常乳和牛常乳樣品各10 份，在4 ℃貯藏，并在2～4 h內運送至實驗室。分析前混合以消除喂養、胎次及個體差異對初乳和成熟乳乳清蛋白的影響，分為3 份進行重復分析。

蛋白酶抑制劑（生化試劑） 瑞士Roche公司；胰蛋白酶（生化試劑） 美國Promega公司；BCA快速蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；所有分離用有機溶劑均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

EASY-nLC 1000納升級液相色譜系統串聯四極桿-靜電場軌道阱（Q-Exactive）高分辨質譜（配有加熱電噴霧離子源及Xcalibur 4.1數據處理系統） 美國Thermo Fisher Scientific公司；FD-5真空冷凍干燥機 美國GOLD-SIM公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將1 mmol/L蛋白酶抑制劑分別添加到50 mL生牛乳和50 mL生羊乳中，并于4 ℃、12 000 r/min離心40 min，獲得乳脂肪層、乳清層和固體顆粒。在乳清層加入10%乙酸溶液調節pH值至4.6，在4 ℃、12 000 r/min離心30 min去除酪蛋白，收集上層清液即為乳清蛋白。使用BCA快速蛋白定量試劑盒分別測定羊乳和牛乳的乳清蛋白含量。

1.3.2 超濾輔助樣品制備消化

將10 μL 100 mmol/L二硫蘇糖醇溶液加入至100 μL蛋白樣品溶液中，56 ℃孵育1 h，以保持蛋白質巰基處于還原狀態，避免蛋白質中半胱氨酸之間形成二硫鍵。冷卻至室溫后，加入終濃度50 mmol/L碘乙酰胺，室溫下避光孵育40 min使巰基烷基化。然后用100 μL UA緩沖液洗滌乳清樣品兩次，50 mmol/L NHHCO溶液洗滌一次。將加有胰蛋白酶的NHHCO溶液加入10 kDa超濾離心管，酶與底物質量比為1∶20，37 ℃過夜酶解。用體積分數1%甲酸溶液終止消化后使用C柱進行脫鹽，凍干，最終復溶在40 μL體積分數0.1%甲酸溶液中進行質譜鑒定。

1.3.3 液相色譜-質譜鑒定及數據分析

色譜條件：將5 μL待測樣品溶液注入C反相色譜柱（100 mm×75 μm，3 μm）中，以IntelliFlow控制流速為250 nL/min，用流動相A（水＋體積分數0.1%甲酸＋4 mmol/L甲酸銨）和流動相B（80%乙腈＋體積分數0.1%甲酸＋4 mmol/L甲酸銨）進行樣品洗脫。洗脫梯度：0～50 min，95%～65% A、5%～35% B；50～95 min，65%～0% A、35%～100% B；95～100 min，0% A、100% B；100～110.1 min，0%～95% A、100%～5% B；110.1～120 min，95% A、5% B。

質譜條件：加熱電噴霧電離離子源，噴霧電壓3.8 kV，RF透鏡電壓55 V，毛細管溫度275 ℃，數據依賴采集模式dd/MS，范圍/300～1 700，正離子模式下一級掃描分辨率70 000（半峰寬/200），二級掃描分辨率17 500，最大離子注入時間120 ms，在線性離子阱中對前20 個響應最高的前體離子進行碎裂，隔離窗口/2，碰撞能量27 eV。前體離子動態排除時間40 s。

1.4 數據分析

質譜原始數據由MaxQuant軟件處理，在選定胰蛋白酶作為消化酶，設置N-端蛋白質乙酰基和氧化為可變修飾、脲甲基化修飾為固定修飾、LFQ定量算法、匹配時間窗口0.7 min和對齊時間窗口20 min等參數，生成蛋白質的定量數據矩陣。SIMCA 14.1軟件建立偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）模型增強聚類效果并識別潛在的生物標志物。利用DAVID生物信息學資源6.8進行基因功能富集分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質譜鑒定及表達差異分析

由于質譜儀鑒定肽段具有一定的長度限制，胰蛋白酶產生酶切肽段的C-末端與具有高度特異性的精氨酸和賴氨酸結合，產生長度適當的堿性肽。圖1為鑒定肽段的長度分布圖，顯示鑒定的肽段包含氨基酸數目大部分為7～20，均在肽段長度合理范圍內，且與質譜鑒定的分子質量范圍（/300～1 700）一致。肽段的精確鑒定可顯著降低假陽性結果出現概率。本實驗使用的Q-Orbitrap質譜儀一級和二級掃描的質量精確度都小于5×10，但為提高鑒定結果的精確性，在Uniprot數據庫搜索肽段匹配誤差閾值設置為0.05 Da。所有已鑒定肽的質量誤差在±5×10范圍內，證明所建立方法的高可靠性和準確性。本研究中，通過肽段在牛乳和羊乳乳清中共鑒定出489 種乳清蛋白，乳清樣品中已鑒定蛋白質的LFQ強度跨越近5 個數量級。

圖1 已鑒定肽段的長度分布Fig.1 Length distribution of identified peptides

對所有已鑒定蛋白質進行Venn分析，分別在牛初乳、牛常乳、羊初乳和羊常乳中鑒定到170、161、240 種和291 種乳清蛋白，其中特征蛋白分別為34、45、85 種和97 種。4 種乳清蛋白質組中47 種乳清蛋白共同表達，包括血凝蛋白、補體成分3和血清白蛋白等。牛常乳為目前應用最廣泛的乳源，與羊初乳和牛初乳相比，牛常乳中鑒定出57 種特征乳清蛋白；與羊常乳相比，牛常乳中鑒定出85 種特征乳清蛋白，包括血清淀粉樣蛋白、-HS-糖蛋白和不溶性彈性結構蛋白等。同時，羊常乳為目前替代牛乳最合適且營養豐富的乳源，與羊初乳和牛初乳相比，羊常乳乳清蛋白中鑒定出109 種特征乳清蛋白。與牛常乳相比，羊常乳中鑒定出110 種特征乳清蛋白，包括-2-糖蛋白1、MAP34-A蛋白和骨橋蛋白等。

2.2 不同泌乳期羊乳和牛乳乳清蛋白化學計量學分析

圖2 4種乳清樣品的PLS-DA模型Fig.2 PLS-DA model for four whey samples

圖3 PLS-DA模型置換檢驗圖Fig.3 Permutation test plot for validation of PLS-DA model

為確定4 組乳清蛋白質組間的生物標志物進行變量投影重要性（variable important in projection，VIP）分析。由圖4可知，組織蛋白酶2、白細胞介素20受體亞單位、PKS-ER結構域蛋白、纖維蛋白原鏈、膜聯蛋白、核結合蛋白2、黑素轉鐵蛋白、乳脂肪球表皮生長因子8蛋白和血小板反應蛋白1這9 種蛋白VIP值大于1，且在羊乳中含量較高，可用于區分牛初乳、牛常乳、羊初乳和羊常乳。膜聯蛋白是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，參與細胞膜和細胞骨架的形成，具有穩定脂質雙層膜骨架作用。同時，膜聯蛋白可通過與甲酰肽受體結合，抑制中性粒細胞滾動，減少中性粒細胞黏附和滲出，從而減少炎癥部位中性粒細胞浸潤和炎性細胞因子釋放。纖維蛋白原是肝臟合成凝血系統的核心蛋白質，在凝血酶作用下形成凝固性纖維蛋白凝塊發揮凝血作用，而纖維蛋白原鏈的翻譯和轉錄是合成整個纖維蛋白原分子的限速步驟。CD5分子樣蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3-5、線粒體ATP合成酶亞單位、橋粒蛋白、含FABP結構域的蛋白質和內質網伴侶蛋白在其他3 組乳中含量較高。其中橋粒蛋白在牛初乳中含量最高，為細胞內橋粒結構的基本組成部分，可通過影響鈉離子通道功能屬性或Cx43蛋白表達分布導致心律失常。本實驗結果表明，與羊乳相比，橋粒蛋白在牛乳清中表達更為廣泛。

圖4 4 組乳清蛋白質組間生物標志物VIP得分Fig.4 VIP scores of biomarkers among whey proteomes from bovine and goat colostrum and mature milk

2.3 不同泌乳期羊乳和牛乳乳清蛋白生物信息學分析

利用DAVID生物信息學資源6.8，根據分子功能、細胞成分和生物過程對牛乳和羊乳中的乳清蛋白進行分類。胞外區、胞外間隙、血液微粒和胞外體是乳清蛋白定位的主要細胞成分，說明這些低豐度蛋白組分是血清中蛋白質在乳腺細胞的緊密連接處通過細胞間或跨細胞傳遞到乳清中。其他蛋白與角蛋白絲、局灶性黏連、血小板顆粒等功能有關。乳清蛋白的主要分子功能有結構分子活性、絲氨酸型內肽酶抑制劑活性以及糖蛋白結合。絲氨酸型肽鏈內切酶抑制劑活性、絲氨酸型肽鏈內切酶活性和結構分子活性在羊常乳中最為豐富，其次是半胱氨酸型肽鏈內切酶抑制劑活性、糖蛋白結合和過氧化還原酶活性。因此，根據蛋白質組學的基因功能富集分析，乳清蛋白可能參與了人類健康相關途徑，而其生物活性在羊乳和牛乳的初乳和常乳中有所不同。

乳清蛋白參與的生物學過程以視網膜穩態和內肽酶活性負調控最為顯著，急性期反應、纖溶和糖酵解過程也占很大比例。羊常乳中，與視網膜穩態、纖溶、先天免疫應答有關的蛋白質數量明顯較多；牛常乳中，與抗菌體液反應相關的蛋白質數量顯著增加。參與糖酵解過程、肽激素分泌的陽性調節和血管收縮陽性調節的蛋白質在羊初乳中表達較高；參與內肽酶活性負調控、急性期反應、抗原處理和通過MHC I類表達肽抗原以及免疫應答的蛋白質在牛初乳中表達較高。進一步研究羊初乳和牛初乳的乳清蛋白差異發現，有170 種蛋白豐度存在顯著差異。牛初乳中有136 種乳清蛋白未被鑒定或含量極低，包括-烯醇化酶、血管緊張素原和補體成分3等。羊初乳中的高表達蛋白與補體激活、內肽酶活性負調節、炎癥反應、細胞遷移、脂質儲存和生物素代謝過程有關；這些特征蛋白的分子功能包括磷脂酰化酶活性、磷脂結合、糖蛋白結合和絲氨酸型肽鏈內切酶抑制劑活性。此外，肌抑制素、凝溶膠蛋白、內質網伴侶BiP、橋粒膠蛋白、黏著素亞單位SA-1等34 種常見蛋白在羊初乳中的豐度明顯高于牛初乳，這些常見蛋白主要與免疫應答、內肽酶活性負調控、視網膜穩態、細胞黏附、骨化和急性期反應相關。這些蛋白在羊初乳中的分子功能包括絲氨酸型內肽酶活性、肝素結合、鈣離子結合、細胞外基質結合和蛋白結合。說明初乳中高水平的抗菌蛋白和免疫活性蛋白可能有助于消除腸道中的致病菌，減少腸道炎癥和敗血癥。羊初乳中急性期反應蛋白的豐度高于牛初乳，可能是由于哺乳初期初生羔羊面臨從無菌環境到微生物環境的脅迫所致。初乳是幫助新生兒建立自身免疫系統的主要營養來源，羊初乳中較高豐度的急性期反應蛋白有助于新生兒建立抗微生物感染的免疫系統。

與其他乳清相比，羊常乳中乳清蛋白共有107 個蛋白豐度存在顯著差異，其中54 種蛋白在羊常乳中特異性表達，包括肌抑制素、中性粒細胞明膠酶相關脂蛋白、凝溶膠蛋白、血凝蛋白、尿苷磷酸化酶2、蛋白S100-A8、黃嘌呤脫氫酶等。羊常乳中，13 種蛋白質豐度顯著高于其他乳，包括肌抑制素、內質網伴侶BiP、肌球蛋白7和前纖維蛋白1等；11 種蛋白質豐度極低或未在羊常乳中鑒定，包括CD5分子樣蛋白、角苔蘚素、纖維連接蛋白、乳膠蛋白和核結合蛋白-1等。值得注意的是，羊常乳中的96 種高表達蛋白中有17 種與免疫應答有關，包括血凝蛋白、中性粒細胞明膠酶相關脂蛋白、骨橋蛋白、補體成分3和S100-A9蛋白等。骨橋蛋白是一種由破骨細胞、成骨細胞、腎細胞和內皮細胞以及活化免疫細胞（如T細胞和巨噬細胞）分泌的磷酸化糖蛋白，參與骨形態發生和調節炎癥細胞動員，在炎癥和組織重塑部位顯著上調，可作為促炎和抗炎細胞因子。中性粒細胞明膠酶相關脂蛋白是一種分子質量25 kDa的分泌糖蛋白，在細菌感染時由先天免疫細胞分泌產生，可通過螯合載鐵分子限制細菌的生長速率。這些結果都表明羊常乳可以有效提高機體免疫力。

黃嘌呤脫氫酶、肌球蛋白7、U6-snRNA相關的Sm樣蛋白LSm4、-乳清蛋白和載脂蛋白A1等17 種羊常乳中高表達的蛋白質與一系列代謝過程有關。在哺乳動物中黃嘌呤脫氫酶和黃嘌呤氧化酶是黃嘌呤氧化還原酶的兩種互換形式。黃嘌呤脫氫酶為其天然形式，主要存在于細胞內部，可通過巰基氧化或有限的蛋白水解作用轉化為黃嘌呤氧化酶。在黃嘌呤脫氫酶到黃嘌呤氧化酶的轉化過程中，具有NAD依賴性脫氫酶和O依賴性氧化酶活性的中間產物可能產生HO和超氧陰離子自由基等活性氧，在過渡金屬存在下通過Haber-Weiss和Fenton反應生成高細胞毒性的羥自由基。黃嘌呤脫氫酶通過產生影響氧化還原平衡的氧化劑參與代謝過程。載脂蛋白A1是高密度脂蛋白的載體蛋白，將膽固醇從周圍組織運輸到肝臟代謝，從而清潔血管壁。血清高密度脂蛋白膽固醇水平越高，人體將血清膽固醇轉運到肝臟代謝的能力越好，從而有效降低動脈粥樣硬化發生的可能性。而載脂蛋白A1水平的升高會增加高密度脂蛋白的合成，因此載脂蛋白A1可通過參與代謝過程降低罹患心血管疾病的風險。

5 種蛋白（內質網伴侶BiP、凝溶膠蛋白、轉錄因子AP-2、雙特異性蛋白磷酸酶和rho-GDP解離抑制劑2）參與了細胞凋亡過程。內質網伴侶BiP是多功能蛋白質，其能與靠近內質網的免疫球蛋白結合蛋白、凝集素鈣蛋白和鈣網蛋白的多肽產生相互作用。對內質網和線粒體Ca串擾的調節是其附加功能之一，這種功能依賴于內質網伴侶BiP與內質網Ca處理機制的相互作用，這種新的附加功能允許內質網伴侶BiP直接控制線粒體凋亡，無需通過未折疊蛋白反應上調促凋亡轉錄因子。內質網蛋白質折疊機制通過控制線粒體氧化磷酸化速率微調ATP的輸入。內質網伴侶BiP在調節內質網線粒體Ca流量中的作用表明，在分泌大量蛋白質的細胞類型中，分泌蛋白折疊的過程是細胞存活和死亡的中心調節器；而在其他類型細胞中，內質網蛋白折疊可能是一種前哨機制，監測細胞的健康狀況，以控制細胞代謝和凋亡。凝溶膠蛋白是一種內源性細胞質蛋白和分泌性血漿蛋白，可以調節肌動蛋白組裝和分解，其裂解產物在多種細胞類型中的表達導致細胞分離、聚集和核碎裂。已有報道通過HEK293T細胞的高轉染效率研究電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion-selective channel，VDAC）蛋白與凝溶膠蛋白之間的相互作用，并證明VDAC與凝溶膠蛋白的G5結構域結合，而不與其他結構域結合。凝溶膠蛋白的G5段顯示VDAC與HIV-Vpr重疊、競爭性結合，G5結構域通過阻斷Vpr與VDAC的結合抑制HIV-Vpr誘導的T細胞凋亡。雙特異性蛋白磷酸酶通過差異表達和對MAPK信號通路的調節在多種類型人類癌癥中發揮作用，其特異性抑制腫瘤壞死因子誘導的p38/MAPK活化，促進細胞凋亡，降低核因子（nuclear factor，NF-）活性。同時雙特異性蛋白磷酸酶在DU145細胞中的過度表達也會通過阻斷p65/NF-核移位促進細胞凋亡和降低NF-活性，從而抑制癌癥發生或延緩發病。

羊乳和牛乳的初乳和常乳中蛋白質顯著表達的前10 條通路如圖5所示。補體與凝血級聯、抗生素生物合成和碳代謝是最顯著的途徑。-抗蛋白酶、補體成分3和補體因子H參與補體與凝血級聯途徑。丙酮酸激酶、-烯醇化酶、核苷二磷酸激酶和補體因子H與抗生素的生物合成有關。PALP結構域蛋白、葡萄糖-6-磷酸異構酶和異檸檬酸脫氫酶參與碳代謝。其他主要途徑有Rap1信號途徑、氨基酸生物合成和溶酶體。根據通路分析，實驗鑒定的乳清蛋白與多種代謝途徑有關。在乳清蛋白中，補體與凝血級聯途徑是天然免疫的介質，可產生具有促炎癥特性的補體裂變產物。在病理生理學中，凝血級聯激活后損傷部位凝血酶的形成可以提供抵御微生物入侵的物理屏障，并觸發補體系統。此外，通過局部刺激產生的過敏毒素可激活細胞免疫應答。Amara等分析體內和體外凝血系統中多種因素與中樞補體成分之間的多重聯系。本實驗中，羊乳清中補體裂變產物的含量高于牛乳，而其中補體因子H有助于胎兒免疫保護，補體成分3和補體成分7可作為防御因子。羊乳和牛乳中乳清蛋白對糖代謝的影響可能與其活性乳清蛋白有關。葡萄糖-6-磷酸異構酶是一種胞漿型非限速酶，能支持特定胚胎脊髓神經元的存活和培養，并介導HL-60細胞分化為終末單核細胞。異檸檬酸脫氫酶作為一種新的角膜晶體蛋白，在促進角膜透明性方面發揮結構和催化作用。Nam等報道隨異檸檬酸脫氫酶表達的減少，3T3-L1前脂肪細胞的脂肪生成減少，葡萄糖攝取和脂肪合成減少。此外，異檸檬酸脫氫酶表達的抑制導致NOX4活性抑制，從而降低分化脂肪細胞的水平。羊乳清中PALP結構域蛋白、葡萄糖-6-磷酸異構酶和異檸檬酸脫氫酶的含量越高，羊乳的降血糖作用越強。

圖5 不同泌乳期羊乳和牛乳蛋白質富集的通路分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of proteins in goat and bovine colostrum and mature milk from

3 結論

在牛初乳、牛常乳、羊初乳和羊常乳中分別鑒定到170、161、240 種和291 種乳清蛋白，47 種蛋白質在4 組乳樣中共同表達，說明雖然羊乳和牛乳之間存在顯著差異，但羊乳在一定程度上可用于替代牛乳。對所鑒定乳清蛋白的LFQ強度建立PLS-DA模型，發現牛初乳和牛常乳在蛋白質組成上比羊初乳和羊常乳更相似，篩選了羊乳中豐度較高的9 種蛋白質用作標志物區分這4 組乳樣。經生物信息學分析發現，鑒定的乳清蛋白主要參與的生物過程為視網膜穩態和內肽酶活性負調控，定位的主要細胞成分是胞外區、胞外間隙、血液微粒和胞外體，主要分子功能為結構分子活性、絲氨酸型內肽酶抑制劑活性和糖蛋白結合。通路分析發現，補體與凝血級聯、抗生素生物合成和碳代謝是最顯著的途徑。在羊常乳中篩選出96 種高豐度蛋白質，大部分與免疫應答、代謝過程及細胞凋亡有關。羊初乳中34 種常見蛋白的豐度明顯高于牛初乳，主要與免疫應答、內肽酶活性負調控和急性期反應相關。研究結果發現羊乳的特征蛋白組成及差異蛋白可能參與的生物過程，加深對羊乳蛋白的認識，對牛乳及其制品的營養改良和母乳替代品的生產具有重要意義。