高鹽稀態醬油發酵優勢真菌與風味物質相關性分析

阮志強，董璽梅，蔣雪薇,2,*，鄒世東，楊俊文，張 偉，吳 燦，方勤軍

（1.長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南 長沙 410114；2.湖南省調味品發酵工程技術研究中心，湖南 長沙 410600；3.加加食品集團股份有限公司，湖南 長沙 410600）

醬油又稱“清醬”或“醬汁”，是我國傳統的調味品。是以蛋白質原料和淀粉質原料為主，經微生物發酵作用，釀造而成的色香味協調、營養物質豐富的調味食品。醬油發酵除了是蛋白質、淀粉等大分子物質降解成氨基酸、多肽及各種糖的過程外，還是各種微生物代謝作用產生酸、醇、醛、酯、酚、酮等與醬油風味密切相關物質的過程。醬油釀造是復雜微生物菌群作用的結果，米曲霉以外的其他有益微生物通過自然接種到醬醪中，在它們的作用下，得到了多種代謝產物，形成了醬油特殊的風味。已分析證明醬油中含有的揮發性風味物質超過1 000 種，分屬13 大類，除一少部分來源于釀造原料外，大部分是微生物代謝作用生成。而有害微生物在醬油釀造過程中形成污染后，則會使醬油出現酸餿味、脹氣等變質現象。因此，探索并解析醬油釀造中微生物群落結構，探討醬油發酵過程中微生物變化規律，將為構建醬油釀造優勢菌群提供理論依據，有利于醬油發酵機制的研究及質量控制。

醬油釀造過程中的真菌主要是米曲霉以及一些耐鹽酵母。米曲霉具有豐富的酶系，可以分解原料中的大分子物質，不僅為耐鹽酵母提供生長所需，還提升了醬油的風味。耐鹽酵母能夠在醬油釀造過程中代謝產生酯、醇、醛、酸、酚、酮等豐富的風味物質，對醬油風味的形成具有重要作用。真菌在醬油發酵中起了提高原料利用率、生成呈味物質及生香作用，其群落結構的變化將會影響醬油主要風味物質的形成，因此，研究醬油發酵過程中真菌群落結構變化是構建有益優勢真菌菌群的基礎。采用高通量測序技術研究高鹽稀態醬油發酵過程中真菌多樣性及群落結構變化，結合發酵過程品質指標及揮發性風味物質分析，探討真菌群落結構變化與醬油風味物質形成的相關性，將為高鹽稀態醬油重要風味物質的形成及品質的提升奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

高鹽稀態發酵醬醪樣品，豆粕-小麥質量比為7∶3，采自湖南某醬油廠。

醬醪發酵周期為6 個月，在發酵過程中不額外添加風味菌。以成品曲加鹽水入罐開始記為0 個月，從0 個月入罐發酵至6 個月出罐，每隔1 個月取一次樣品，分別記為S0～S6。取樣前對發酵罐內醬醪樣品進行通氣攪拌，取混合均勻的醬醪樣品約500 mL，冰袋冷藏運回實驗室保存在－80 ℃低溫冰箱中備用。

1.1.2 培養基與試劑

孟加拉紅培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 美國Bioo Scientifci公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3 美國Illumina Scientifci公司；2-甲基-3-庚酮 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

5424R高速臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；ELx800酶標儀 美國BioTek公司；Quantus? Fluorometer微型熒光計 美國Promega Scientific公司；DYYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；GeneAmp9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Illumina MiSeq測序儀美國Illumina Scientific公司；436 GC/EVOQ TQ/PAL氣相色譜-質譜聯用儀 美國Bruker Daltonics公司；DB-5MS色譜柱 美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取針 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌總數測定

參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》的方法。

1.3.2 還原糖、氨基酸態氮及總酸的測定

還原糖測定：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》直接滴定法；總酸測定：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》氫氧化鈉滴定法；氨基酸態氮測定：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》甲醛滴定法。

1.3.3 高通量測序分析

1.3.3.1 真菌總DNA提取及PCR擴增定量

采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒對醬醪中真菌的總DNA進行提取，然后通過NanoDrop 2000分光光度計檢測提取DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳確定DNA完整性后，置于－20 ℃保存備用；分別使用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）對ITS1區基因進行PCR擴增。

PCR擴增體系為5×FastBuffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、5 μmol/L Forward Primer 0.8 μL、5 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL、FastPolymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng，用ddHO補齊至20 μL。PCR程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環30 次；最終72 ℃延伸10 min。每個樣本進行3 個PCR重復，將3 個重復PCR產物混合；使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，確定其在250～500 bp有條帶后，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行回收產物純化，并用QuantusFluorometer對回收產物進行檢測定量。

1.3.3.2 高通量測序與數據分析

樣本的建庫和測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。針對真菌ITS1F_ITS2R區序列，設計帶barcode標簽的特異引物，測序平臺為Illumina MiSeq PE300。根據測序序列barcode和引物區分樣品，使用Trimmomatic軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接。按照獲得的最小樣本序列數對測序樣品進行抽平，使用UPARSE軟件以97%的相似度對抽平后的序列進行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對序列進行物種分類注釋，比對Unite數據庫（真菌ITS數據庫），閾值設為70%。根據樣品的OTU及序列關系，采用Mothur軟件對樣品進行多樣性分析，計算各種物種多樣性指數，衡量樣本物種多樣性。每個樣品測定3 個平行，測序結果取均值用于下一步分析。

1.3.4 揮發性風味物質檢測

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用技術檢測分析醬油中揮發性風味物質，每個樣品平行測定3 次。

HS-SPME條件：取壓榨醬油，添加5 μL 0.816 μg/μL 2-甲基-3-庚酮的甲醛溶液作為內標物，總體積為2 mL，在50 ℃加熱振蕩樣品20 min，萃取頭萃取20 min后進樣；GC條件：進樣口溫度250 ℃，解吸5 min，程序升溫條件為40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，以7 ℃/min升溫至230 ℃，保持2 min，載氣為高純氦氣，載氣流速為1.0 mL/min，不分流進樣；MS條件：電子電離源，電子能量為70 eV，發射電流為200 μA，傳輸線和離子源溫度為250 ℃，離子碎片質量掃描范圍為/40～500。

揮發性化合物定性分析：采用NIST 14譜庫進行檢索比對，再根據保留時間和標準質譜比對確定物質結構。

揮發性化合物質量濃度計算如下式所示：

式中：為揮發性物質質量濃度/（mg/L）；為內標物質量濃度（0.816 μg/μL）；為揮發性物質峰面積；為內標物峰面積；為醬油的體積/mL；為添加內標物的體積/μL。

1.4 數據分析

采用SPSS 22軟件對數據進行處理，相關性分析采用雙變量Pearson檢驗，顯著性水平設為5%，Origin 2021繪圖；揮發性風味物質含量數據經標準化處理后，TBtools軟件進行熱圖繪制。

2 結果與分析

2.1 高鹽稀態醬油發酵過程中真菌總數、還原糖、氨基酸態氮及總酸變化

醬油發酵中的真菌主要有霉菌及酵母，米曲霉是醬油發酵的主要菌種，在醬油發酵過程中起著將蛋白質及淀粉降解的作用，而酵母多在醬油發酵中后期出現，對醬香風味有比較重要的貢獻，因此，發酵過程中存在一定數量的真菌對于醬油的品質有重要的作用。對高鹽稀態醬油發酵過程中真菌進行計數（圖1），結果顯示，入罐發酵（0 個月）時醬醪樣品的真菌數量最高，為7.8×10CFU/g（醬醪質量計，下同），隨著發酵的進行，真菌數量呈下降趨勢，發酵結束時為5.8×10CFU/g，說明隨著發酵的進行，醬醪中的真菌死亡速率高于生長速率。發酵2～3 個月，真菌數量速率趨緩，這時的醬醪發酵真菌適應了鹽鹵發酵，生長速率僅略低于死亡速率；而經過3～4 個月的快速下降后，4～6 個月又出現了真菌數量的穩定，說明在發酵中后期，耐鹽酵母的生長使醬醪中的真菌數量達到了動態平衡。

圖1 高鹽稀態醬油發酵過程中真菌總數變化Fig.1 Variation in the number of fungi during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

醬油發酵過程中的糖類物質來源于原料中的淀粉降解，糖類物質除了為醬油提供甜味外，還是醬油風味物質的碳架來源，對醬油風味物質積累及滅菌中的美拉德反應極為重要；醬油發酵過程中的氨基酸類物質來源于原料中的蛋白質分解，其中谷氨酸、天冬氨酸等是醬油中呈鮮味物質的主要來源，也是醬油分級的重要指標；醬油發酵過程中的酸類物質是糖類物質發酵的結果，酸類物質能賦予醬油爽口的風味、醇厚感及回甜感，還能與醇類物質形成酯提升醬油的香氣。醬油發酵過程中通過分析還原糖、氨基酸態氮和總酸含量變化考察上述3 類物質的變化，因此，還原糖、氨基酸態氮和總酸可以作為衡量醬油品質的重要指標，同時也是監控發酵過程的重要參數。從圖2可以看出，發酵1 個月，還原糖、氨基酸態氮都出現了較大速率的增長，其中還原糖達到了峰值47.37 g/L，這是由于在發酵初期，米曲霉產生的淀粉酶、蛋白酶活性較高，醬醪中其他微生物還未形成優勢生長，還原糖及氨基酸態氮的生成速率大于消耗速率所致；總酸在此階段也出現了較大的增長，其原因是醬醪中耐鹽細菌開始生長并代謝產生有機酸。發酵1 個月之后，還原糖被微生物消耗利用，含量不斷下降，發酵結束時為17.73 g/L；發酵3 個月，氨基酸態氮已達到10.45 g/L，隨著微生物對其利用速率的增大，上升趨勢變緩，發酵結束時質量濃度為10.72 g/L；還原糖除發酵生成有機酸外，還生成醇、醛類物質等，隨著發酵的進行，有機酸與醇類物質酯化，導致了總酸增速減緩，發酵結束時質量濃度為21.68 g/L。

圖2 高鹽稀態醬油發酵過程中還原糖、氨基酸態氮及總酸的變化Fig.2 Variation in reducing sugars,amino acid nitrogen,and total acid during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

2.2 高鹽稀態醬油發酵過程中真菌α多樣性變化

復雜微生物發酵體系的多樣性研究有利于探明其菌群結構并實現優化。高鹽稀態醬醪也是一個多菌種的發酵體系，真菌在其發酵過程中對于原料的降解以及主要風味物質的積累起著比較重要的作用，因此，研究醬醪發酵體系的真菌多樣性，有利于高鹽稀態醬油發酵的優化。多樣性分析可以表征微生物群落的豐富度和多樣性。其中覆蓋率是指各樣品文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列未被檢測出的概率越低；ACE指數和Chao1指數與樣品微生物群落的物種豐富度呈正相關，可以反映樣品中微生物群落的豐富度；Shannon指數與樣品微生物群落的物種多樣性呈正相關，而Simpson指數與其相反，可以反映樣品中微生物群落的多樣性。6 個月發酵周期共計7 個樣品的測序數據經過濾和質量控制后，共獲得949 843 條有效序列，按照最小樣本序列數對所有樣品序列進行抽平，以97%的相似度水平對抽平后的序列進行OTU聚類，共獲得65 個OTU，每個樣品含有的OTU數及多樣性指數數據如表1所示。

表1 高鹽稀態醬油發酵過程中真菌OTU數及α多樣性Table 1 OTU number and alpha diversity of fungal community during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

由表1可知，各個樣品的覆蓋率均達到了0.999以上，測序樣品數據能夠代表醬醪樣品中真菌群落的真實情況。樣品真菌群落物種豐富度和多樣性方面，ACE指數和Chao1指數呈現發酵0～1 個月降低、1～4 個月升高、4～5 個月再降低、5～6 個月重新升高直至最高，說明發酵過程中醬醪樣品的物種豐富度在波動變化中升高，這應該是由于隨著醬油發酵的進行，制曲帶入的真菌不適應高鹽環境逐漸消亡而耐鹽真菌開始生長繁殖所致。從Shannon指數和Simpson指數看，在發酵過程中醬醪樣品真菌的物種多樣性呈現0～2 個月升高、2～4 個月降低、4～6 個月再升高的趨勢。結合圖1中真菌數量變化，發酵0～2 個月，真菌總數降低，而物種多樣性升高，說明在此階段制曲時的不耐鹽真菌數量開始減少，其他的耐鹽真菌開始生長，從而形成了真菌總數降低、物種多樣性升高的現象；發酵2～3 個月，真菌總數保持平穩，物種多樣性降低，說明前期開始生長的耐鹽真菌逐步成為優勢菌，而不耐鹽真菌則出現消亡，此消彼長保持了真菌總數的平穩，但物種多樣性降低；發酵4～6 個月，真菌總數保持平穩，物種多樣性重新開始升高，說明在此階段耐鹽真菌出現了多樣化，而前期生長的耐鹽真菌數量下降，從而形成了真菌總數平穩、物種多樣性升高的現象。

2.3 高鹽稀態醬油發酵過程中真菌群落結構變化

根據物種分類注釋結果，7 個樣品共獲得30 個真菌科、44 個真菌屬，其中S0～S6樣品分別獲得29、8、13、20、11、13 個和22 個真菌屬。選取相對豐度較高的9 個真菌屬繪制物種豐度圖（圖3）。從圖3可以看出，在7 個醬醪樣品中占據優勢地位的真菌分別為曲霉屬（）、柯達酵母屬（）、接合酵母屬（），3 個真菌屬的相對豐度之和均超過了99%。制曲是大量培養米曲霉的工序，成品曲加鹽水入罐發酵為0月，此時曲霉屬的相對豐度很高，達到了93.85%，隨著發酵的進行，高鹽環境是曲霉的菌絲萎縮而逐漸消亡，此外在發酵前期醬醪中的產乳酸細菌開始增殖并分泌有機酸，降低了醬醪的pH值，進一步促進了曲霉屬的消亡。圖中顯示曲霉屬在1～4 個月占比逐漸降低，分別為82.31%、62.62%、14.28%和0.43%，而4～6 個月則保持相對穩定，這與之前物種多樣性結果相符。柯達酵母屬的相對豐度變化呈現先升高后降低的趨勢，在0月占比為5.17%，發酵1～4 個月占比逐漸增加并達到最大值，分別為17.60%、37.31%、85.64%和99.50%；發酵5～6 個月從99.28%降至20.33%，被中后期生長的耐鹽真菌所取代。柯達酵母屬被報道能降解生物胺和生產絮凝劑，從生姜獼猴桃酒醅、腌魚、腐乳等發酵食品中也有分離，還有研究將其作為污染菌從腐爛的泡菜中分離出，但醬醪中分離出柯達酵母屬則鮮見報道。接合酵母屬在0～4 個月占比較低，相對豐度不超過0.01%，在5～6 個月開始增長，占比從0.40%迅速增至78.12%。接合酵母屬中的魯氏酵母（）是醬醪中常見的耐鹽酵母，能代謝積累醇類（特別是乙醇），還能通過酯化作用形成多種酯類，豐富醬油的風味，常作為生香酵母應用于醬油發酵。在本批發酵中，接合酵母屬出現較晚，僅在最后一個月形成了優勢生長，不利于醬油在較短的時間內生香并形成成熟的風味，因此可以考慮在醬油發酵中期（3～4 個月）添加接合酵母以促進醬香風味的形成并縮短發酵周期。此外，假絲酵母屬（）在樣品中也少量存在，在發酵過程中占比均未超過0.3%，有報道埃切假絲酵母（）對醬油風味也有貢獻。

圖3 屬水平物種豐度圖Fig.3 Microbial richness at genus level

2.4 高鹽稀態醬油發酵過程中揮發性風味物質變化

利用HS-SPME-GC-MS對高鹽稀態醬油發酵過程樣品揮發性風味物質進行分析（表2），結果顯示，7 個樣品共檢測出61 種揮發性風味物質，其中酯類物質14 種，醇類物質12 種，酮類物質10 種，醛類物質8 種，酸類物質7 種，酚類物質4 種，其他物質（吡嗪類物質等）6 種。揮發性風味物質總含量在發酵0～1 個月下降，入罐發酵時醬醪樣品的揮發性風味物質多來自于原料，隨著發酵的進行，原料逐漸被降解利用，因此0～1 個月揮發性風味物質含量下降；發酵1～6 個月總含量逐漸上升，到6 個月發酵結束時，揮發性風味物質總質量濃度最高，為12 404.15 μg/L。其中醇類物質質量濃度最多，為8 826.2 μg/L，主要在發酵5～6 個月積累，這與接合酵母屬的變化趨勢一致，顯示醇類物質的積累與其有密切的關系；酸類物質質量濃度位居第二，為2 349.97 μg/L，其積累從發酵4 個月開始，在發酵結束時達到最高，與發酵過程的總酸趨勢比較一致，與醬醪中的細菌有關；醛類物質質量濃度處于第三，為524.18 μg/L，其積累也是從發酵5 個月開始，這與醬醪中的接合酵母屬有關；本批發酵酯類、酮類、酚類質量濃度不高，分別為324.81、304.34、69.19 μg/L；酯類物質含量在發酵4 個月達到最大值，發酵5 個月含量驟減，說明酯類物質的產生可能與柯達酵母有關，而發酵后期隨著接合酵母形成優勢，柯達酵母逐步減少，接合酵母積累的醇類物質也合成了少量酯類，致使發酵6 個月，酯類物質又出現了小幅升高，但結束時總體含量較低；酮類和酚類物質的積累也主要在發酵后期，這些物質占比較低，具有一定的豐富醬油香氣的作用。總體看來，本批發酵揮發性風味物質含量不夠均衡，與真菌菌群結構形成明顯的由米曲霉→柯達酵母→接合酵母的演替有關，且采用豆粕-小麥為7∶3的原料發酵，原料中的碳源較少而氮源豐富，導致發酵前中期酵母類真菌及細菌生長不利，各類揮發性風味物質的大量積累延遲到了發酵5～6 個月。而氨基酸態氮則在發酵3 個月就已達到特級醬油的標準（10 g/L），其主要原因是發酵前3 個月米曲霉為優勢菌。根據醬油發酵過程真菌群落結構及揮發性風味物質變化的研究可以發現，揮發性風味物質的積累與菌群結構有著密切的關系，可以通過改變菌群結構達到優化揮發性風味物質的效果。

表2 高鹽稀態醬油發酵過程中揮發性風味物質變化Table 2 Changes in volatile flavor compounds during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

2.5 高鹽稀態醬油發酵過程中優勢真菌與揮發性風味物質變化的相關性

進一步研究各物質與醬醪中真菌菌群的關系，從檢測到的揮發性風味物質中選取了香氣活性值（odor activity value，OAV）大于1的11 種物質，將其含量標準化數據隨發酵時間的變化繪制成熱圖。由圖4可知，對醬油總體風味影響較大的揮發性風味物質多在發酵5、6 個月生成積累，其中影響較大的醇類物質為苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和1-辛烯-3-醇，醛類物質為苯甲醛、苯乙醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和癸醛，酯類物質為乙酸乙酯，酚類物質為4-乙基愈創木酚。

圖4 高鹽稀態醬油發酵過程中香氣活性值大于1的揮發性風味物質含量變化Fig.4 Changes in volatile flavor compounds with odor activity over 1 during the fermentation of high-salt liquid-state soy sauce

利用SPSS軟件分析醬醪中優勢真菌屬與這些物質之間的相關性。由表3可知，柯達酵母屬與11 種風味物質均無顯著相關性，說明柯達酵母屬對醬油風味沒有明顯促進作用，其在醬油發酵過程中發揮的作用還有待研究。曲霉屬與1-辛烯-3-醇呈顯著正相關（＜0.05），1-辛烯-3-醇具有蘑菇的香氣，只在0 個月樣品中檢測到，另外根據Zhao Jianxin和Lee等的研究，在添加米曲霉發酵的豆醬中均檢測到1-辛烯-3-醇，1-辛烯-3-醇可能來源于制曲階段，推測與醬油制曲中的米曲霉代謝有關。接合酵母屬與苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、苯甲醛、乙酸乙酯等多種物質呈顯著正相關（＜0.05），說明接合酵母屬是醬油發酵后期的重要菌屬，屬于多種風味物質的主要產生菌。

表3 優勢真菌與主要風味成分的相關性Table 3 Correlation between dominant fungi and major falvor components

醇類物質主要由酵母菌經過糖酵解途徑或Enrlich途徑產生，在醬油風味中占有很大的比重，是醬油中醇香風味的主要來源，同時作為酯化反應的前體物質對酯類物質的形成具有重要的作用。苯乙醇具有玫瑰香氣，是酵母菌降解苯丙氨酸的產物，3-甲基-1-丁醇具有蘋果白蘭地香氣，2-甲基-1-丁醇具有麥芽香，能賦予醬油香氣的濃郁感，與接合酵母屬呈顯著正相關。小分子醛類物質主要是微生物在碳代謝中產生，含量一般較低，但對醬油香氣具有一定調和作用，可賦予醬油清香、果香和堅果香等芳香。苯甲醛具有特殊的杏仁氣味，對構成醬香有一定的作用。苯乙醛具有風信子、紫丁香樣的香氣，3-甲基丁醛具有蘋果香氣，這兩種風味物質具有較高的香氣活性值，可由苯乙醇和3-甲基-1-丁醇經過氧化脫氫生成，與3 種優勢真菌均無顯著相關性。醬油中的酯類物質主要通過由酵母菌產生的酶催化生成，多以乙酯的形式存在，如乙酸乙酯等，在醬油中起著香甜、濃郁而柔和的基底作用，賦予醬油甜香和果香的氣味。酚類物質大多具有香氣明顯的特征，對醬油風味有較大貢獻，4-乙基愈創木酚是醬油的特征風味物質，具有典型煙熏氣味，與接合酵母屬呈顯著正相關，目前沒有研究報道接合酵母屬直接代謝生成4-乙基愈創木酚，可能是由細菌或其他酵母代謝積累。酸類物質主要由乳酸菌等產酸細菌生成，可以將發酵體系轉變為偏酸的環境，能在一定程度上抑制雜菌的污染，還可以作為前體物質參與酯類的生成。

3 結論

應用Illumina MiSeq高通量測序技術研究高鹽稀態醬油發酵過程真菌群落結構變化及優勢真菌，結合隨發酵時間變化的醬油重要品質指標還原糖、氨基酸態氮、總酸及揮發性風味物質含量的變化，得出以下結論：1）高鹽稀態醬油發酵過程中檢出44 個真菌屬，其中曲霉屬為發酵0～2 個月的優勢真菌；柯達酵母屬為發酵3～5 個月的優勢真菌；接合酵母屬在發酵6 個月時占優勢地位。2）還原糖含量在發酵0～1 個月快速上升，達到峰值47.37 g/L，隨后質量濃度不斷降低，發酵結束時為17.73 g/L；與醬油呈味密切相關及醬油分級的重要指標氨基酸態氮含量在發酵0～3 個月快速上升，隨后增速放緩，發酵結束時為10.72 g/L；總酸含量在發酵0～3 個月上升較快，4～6 個月增速放緩，發酵結束時為21.68 g/L。3）醬油發酵過程中共分析出61 種揮發性風味物質，發酵結束時總質量濃度為12 404.15 μg/L，其中醇類物質和酸類物質含量較高；對發酵優勢真菌與揮發性風味物質進行相關性分析發現，發酵后期出現的優勢真菌接合酵母屬與多種酯類物質、醇類物質、醛類物質等呈顯著正相關，對于醬油風味的形成具有重要的作用，而發酵中期的優勢真菌柯達酵母屬則顯示與揮發性風味物質無顯著相關性。

高鹽稀態醬油發酵過程中真菌群落結構變化及優勢真菌與醬油品質及風味具有比較顯著的相關性，因此構建有益的醬油發酵真菌群落將有利于提升釀造醬油品質。