NMR和GC-MS研究加熱對奶油主要成分及香氣化合物的影響

葉婷婷，劉思佚，劉 潔，楊曉瑩，趙子建，陳德慰

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004）

奶油是以未均質化前的生牛乳為原料，分離含脂部分的一種淡黃色半固體食品。奶油中的脂質主要為甘油三酯，在總脂質中的含量超過98%，主要碳水化合物為乳糖，是由單糖葡萄糖和半乳糖組成的二糖。淡奶油中乳糖含量為3.7%～4.0%，而脂肪含量較高的鮮奶油中乳糖含量為2.8%～3.0%。奶油中的氨基酸含量約2.6%，其中以天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸和酪氨酸含量較高。

奶油中的關鍵香氣物質已被廣泛報道，香氣活性物質主要來自脂類的水解和氧化反應，以及氨基酸參與的美拉德反應。在奶油關鍵香氣物質中，丁酸、-癸內酯、-十二內酯和2-庚酮分別呈黃油味、蜜桃味和藍紋芝士等香氣特征；(,)-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-酮分別表現出脂肪味和類似蘑菇、金屬的氣味；2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、甲基吡嗪、糠醛和麥芽酚分別表現出巧克力味、烘烤味、焦糖味和甜味。在這些化合物中，短鏈脂肪酸、內酯和甲基酮來源于飽和脂肪酸；不飽和醛和1-辛烯-3-酮來自不飽和脂肪酸的氧化；2-甲基丁醛和3-甲基丁醛來自Strecker降解；烷基吡嗪、呋喃和麥芽酚不僅可以由美拉德反應生成，也可以由焦糖化反應生成。

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術因其快速方便、準確且專屬性強的優點，已被廣泛用于乳制品領域，近年來常用于乳制品中碳水化合物、氨基酸、脂肪酸的分析。對于香氣物質的分析鑒定，頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextration-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術已被廣泛運用，也是目前提取香氣物質最有效的方法之一。因此，將NMR和HS-SPME-GC-MS結合使用對奶油主要成分的定量和香氣物質的鑒定具有非常理想的效果。

奶油因為其香濃的氣味而被廣泛喜愛，也常被用于焙烤食品的制作，也因其脂質含量高的特點，普遍認為奶油風味來源僅為甘油三酯。本實驗分別利用NMR和GC-MS測定加熱前后奶油中的主要成分和揮發性化合物的組成，研究分析其變化機理，以期為奶油風味和產品的研究提供思路；同時根據加熱過程中奶油主要成分和香氣化合物的聯系，進一步討論奶油組分在其香氣化合物形成中的作用，為開發一種風味增強劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶由廣西大學奶牛養殖基地提供。

氘代水（DO）、3-(三甲基硅基)丙磺酸鈉鹽（3-(trimethylsilyl)-1-propane sulfonic acid silane，DSS，0.001 g/100 μL）、氘代氯仿（99.8% CDCl＋0.03%四甲基硅烷） 上海麥克林生化科技有限公司；香氣化合物標準品：2-甲基丁醛、壬醛、麥芽酚、()-2-戊醛、己醛、對甲苯酚、辛醛、苯酚、(,)-2,4-癸二烯醛、(,)-2,4-庚二烯醛、()-2-壬烯醛、()-癸烯醛、2-呋喃甲醇、庚醛、糠醛、己酸、2,4-二叔丁基苯酚、2-戊基呋喃、辛酸、辛酸乙酯，2(5)-呋喃酮、5-甲基-2-呋喃醛、2-乙?；秽?、2,3-二甲基吡嗪和正構烷烴 上海Sigma-Aldrich貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機 天美（中國）科學儀器有限公司；AVANCE III HD 600 NMR儀 德國Bruker公司；SAAB-57328U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；7890B-5975 GC-MS儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參考Kanno等的方法并稍作調整。取1.00 kg鮮牛奶，水浴加熱至38 ℃后，立即在20 ℃、6 380×離心20 min，收集上層奶油，于4 ℃條件下貯存。

取0.50 g新鮮奶油置于容器中，用鋁箔紙密封。由于奶油通常用于焙烤食品的制作，如曲奇餅干焙烤溫度通常為160～200 ℃，時間為15～30 min。因此將奶油置于160 ℃加熱30 min，即為加熱奶油樣品。每次測量前取2 份相同新鮮奶油，一份作為加熱前奶油樣品，另一份制備加熱奶油樣品。每組樣品一式3 份，取自同一批鮮牛奶。

1.3.2 NMR分析

稱量0.50 g新鮮奶油于2 mL EP管中，分別加入1 mL DO和1 mL CDCl，漩渦至樣品溶解，靜置分層。取550 μL水層，添加50 μL內標DSS，混合均勻后轉移至5 mm核磁管中，同樣移取600 μL CDCl層于另一核磁管中，待測。稱量0.50 g新鮮奶油于160 ℃加熱30 min后，轉移至2 mL EP管中，其余操作步驟與新鮮奶油一致。

H-NMR譜測定條件：載波頻率500 Hz，檢測溫度25 ℃，譜寬10 ppm，弛豫時間10 s，獲取數據點16 000。為采集DO和CDCl中的H-NMR譜，掃描次數分別為32和64。同時通過預飽和抑制水信號。NMR光譜處理和標峰使用MestReNova（14.1.1）軟件完成。在計算各化合物峰值時采用全局光譜去卷積算法對重疊區域進行反卷積，以對在擁擠光譜區域出現共振的化合物進行絕對定量。在H-NMR譜中信號面積與樣品中存在的質子數成正比，分別對DO和CDCl的H NMR譜圖中單個信號進行積分，并通過與內標信號比較，計算極性和非極性組分含量。奶油中極性組分含量表示為每100 g（干質量）奶油中所含極性組分的質量，單位為%；非極性組分含量表示為每100 moL奶油中所含組分的物質的量，單位為%。

1.3.3 HS-SPME

參考Guo Dong等的方法并稍作調整。樣品制備好后轉移至頂空瓶，將頂空瓶于50 ℃水中平衡5 min。將已老化好的萃取頭插入樣品瓶中，用手柄推出石纖維頭，將其暴露在瓶內上方，恒溫50 ℃萃取60 min，用手柄將纖維頭推回針頭內，拔出萃取頭插入GC-MS進樣器中解吸3 min。

1.3.4 GC-MS分析

使用極性D B-WA X 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），升溫條件：柱初溫40 ℃，維持2 min，以3 ℃/min上升至225 ℃，維持1 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，維持5 min。進樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，載氣He，質量掃描范圍/30～350。數據存儲在化學工作站。通過把質譜圖與NIST 14質譜數據庫中的化合物圖譜進行匹配對化合物進行初步定性，再利用同一條件下正構烷烴的保留時間計算每個化合物的保留指數（retention index，RI），同時和NIST數據庫比較對樣品進一步定性。本實驗旨在比較加熱前后奶油樣品中同一化合物含量的相對變化，因此未對揮發性化合物進行準確定量，僅利用峰面積表示其含量。

1.4 數據分析

NMR和GC-MS的數據使用SPSS 23.0軟件進行獨立樣本檢驗，顯著水平=0.05。

2 結果與分析

2.1 1H NMR定量分析加熱前后奶油非揮發性組分的變化

圖1為加熱前后奶油中極性組分的H NMR譜圖，為便于觀察比較，未加熱奶油和加熱后奶油采用相同比例繪制。由圖1和表1可知，在加熱前后奶油極性組分存在較大差異。乳糖是奶油中含量最高的極性組分，含量為3.861%，一般鮮奶油中乳糖含量為2.8%～4.0%。加熱后乳糖含量減少了74%，因為乳糖經過熱處理會分解為半乳糖和葡萄糖，然后與氨基酸發生美拉德反應。而僅在加熱后奶油中檢測到乳糖的分解產物葡萄糖，含量為0.085%。除碳水化合物，在新鮮奶油中還檢測到少量游離氨基酸，加熱后天冬氨酸含量減少得最多，加熱前天冬氨酸（0.234%）是新鮮奶油中含量最高的氨基酸，加熱后含量減少了84%；其次是甲硫氨酸（0.045%），加熱后含量減少了80%；亮氨酸（0.154%）、酪氨酸（0.043%）、苯丙氨酸（0.051%）、纈氨酸（0.056%）和異亮氨酸（0.042%）加熱后含量分別減少了82%、79%、78%、75%、71%；丙氨酸（0.027%）、精氨酸（0.118%）和賴氨酸（0.118%）的含量加熱后分別減少了67%、35%和18%。游離脂肪酸含量也變化顯著，尤其是丁酸含量（0.148%）加熱后減少了93%；甲酸（0.011%）和乙酸含量（0.004%）在加熱后分別減少了75%和43%。在新鮮奶油中還檢測到乳酸（0.472%）和琥珀酸（0.003%），這可能來源于乳糖的發酵，加熱后乳酸含量減少了64%，而琥珀酸已被消耗完全。這些極性組分在加熱前后均表現出顯著的含量變化。乳糖和游離氨基酸含量的減少可能與加熱過程中美拉德反應的進行密切相關，而有機酸含量的減少則可能是因為加熱過程中溫度升高使這些化合物揮發，從而含量大幅降低。

圖1 加熱前后奶油中極性組分的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectra of polar components in cream before and after heating treatment

表1 加熱前后奶油中極性組分含量變化Table 1 Changes in contents of polar components in cream before and after heating treatment

圖2為加熱前后奶油中非極性組分的H NMR譜圖。0.8～0.9處的三重信號由飽和脂肪酸、油酸和亞油酸?；霞谆|子共同引起；1.2～1.4處的信號由酰基鏈上多個亞甲基的質子引起；1.5～1.7和2.2～2.3處的信號分別由相對于羧基位于位置和位置的亞甲基質子引起；1.9～2.1是由?；溕吓c單個雙鍵相連的位置的亞甲基質子引起；2.03處的信號由脂肪酸?；溕系南┍|子引起；2.7和2.8處的信號分別由亞油酸和亞麻酸?；溨邢鄬τ趦蓚€雙鍵位于位的亞甲基質子引起；3.7處的雙重信號由1,2-雙甘酯在甘油基-3位的亞甲基質子引起；3.85處的雙重峰為2-單甘酯-1和-3位置上的質子給出的信號；3.99處的多重峰歸屬于1-單甘酯-2位的質子；4.1～4.3和5.2分別由甘油三酯中甘油基的-1,3位和-2位的質子引起；5.3～5.4則是由不同?；溕系南N質子引起。

圖2 加熱前后奶油中非極性組分的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectra of apolar components in cream before and after heating treatment

通過將特定的信號與4.2處甘油三酯甘油基上-1,3位的氫質子信號聯系，對甘油酯中單個脂肪酸進行量化。由表2可知，加熱前奶油中飽和脂肪酸在總脂肪酸中的相對含量75.87%，不飽和脂肪酸為24.13%，其中油酸21.63%、亞油酸2.11%、亞麻酸0.39%。文獻[26]報道，奶油中的飽和脂肪酸在總脂肪酸中占比可達70%，而不飽和脂肪酸占比30%，其中油酸26%、亞油酸3%、亞麻酸0.6%，與本實驗中測得的脂肪酸含量基本一致。經加熱處理后，飽和脂肪酸含量減少了18%，不飽和脂肪酸含量減少了23%。不飽和脂肪酸更易發生氧化，因此在相同條件下其含量較飽和脂肪酸減少更多。在不飽和脂肪酸中，亞油酸含量減少最為顯著，加熱后含量減少了59%；其次是亞麻酸，加熱后含量減少了23%；最后是油酸，加熱后含量減少了20%。除脂肪酸之外，還在奶油中檢測到1,2-雙甘酯（0.65%）、1-單甘酯（0.21%）、2-單甘酯（0.05%），這是因為少量甘油三酯發生水解，先水解成1,2-甘油二酯，再水解成1-單甘酯和2-單甘酯，3 種物質加熱后含量分別減少了17%、14%、54%。非極性組分中脂肪酸含量的減少可能是因為加熱過程中的氧化以及甘油酯水解產生的部分短鏈脂肪酸形成了奶油中的香氣化合物。

表2 加熱前后奶油中非極性組分的含量變化Table 2 Changes in contents of apolar components in cream before and after heating treatment

2.2 GC-MS分析加熱前后揮發性香氣物質的變化

圖3對比了加熱前后奶油中揮發性化合物總離子色譜圖。由表3可知，在未加熱奶油中，脂質來源的香氣化合物普遍存在，經過加熱后這些化合物的含量均有所增長。丁酸、己酸和辛酸含量在加熱后分別增加至加熱前的4、2 倍和6 倍以上，癸酸含量在加熱后增加至46 倍，這可能是因為加熱后甘油三酯脂肪酸鏈的水解使得飽和脂肪酸含量增加。甲基酮和內酯分別來自飽和脂肪酸的-氧化和羥基酸的內酯化，2-戊酮、2-庚酮和2-壬酮含量在加熱后分別增加至加熱前的36、215 倍和157 倍，-己內酯、-辛內酯、-癸內酯和-十二內酯的含量在加熱后分別增加了42、44、48 倍和91 倍。以亞油酸為前體的己醛、()-2-壬烯醛、(,)-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-酮的含量在加熱后分別增加了4、10、28 倍和25 倍，以油酸為前體的壬醛在加熱后含量增加了2 倍。

圖3 HS-SPME-GC-MS測定加熱前后奶油中揮發性化合物的總離子色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of volatile compounds in cream before and after heating treatment

表3 加熱前后奶油樣品中的關鍵香氣物質Table 3 Key odorants identified in the headspace of cream samples before and after heating treatment

在未加熱奶油中檢測到少量美拉德反應產物，如2-甲基丁醛和3-甲基丁醛，其含量在加熱后分別增加了10 倍和6 倍；糖降解產物糠醛也在未加熱奶油中被檢測到，其含量在加熱后增加了179 倍。當溫度達到50 ℃時會發生美拉德反應，而揮發性香氣物質的萃取是在50 ℃水浴下進行，這可能是在未加熱奶油中發現這些美拉德產物的原因。而其他美拉德反應產物，如甲硫基丙醛、甲基吡嗪、麥芽酚和呋喃酮，均只在加熱后奶油中檢測到。

2.3 風味前體物質對奶油香氣形成的影響

麥芽酚在加熱奶油的關鍵香氣物質中含量最高，麥芽酚是二糖的特異性產物，加熱過程中少量乳糖在氨基酸影響下被轉化為麥芽糖，再經2,3-烯醇化形成麥芽酚。此外，美拉德反應中生成的Amadori產物也可直接形成麥芽酚。乳糖是奶油中含量最高的極性組分（表1），也是奶油中唯一的還原性二糖，因此加熱后乳糖的大量減少與麥芽酚的形成密切相關。加熱后呋喃類化合物含量的增加也較顯著。呋喃形成的5 種主要途徑為多不飽和脂肪酸的氧化、碳水化合物的熱降解、還原糖與氨基酸的美拉德反應、抗壞血酸及其衍生物的分解，以及類胡蘿卜素的氧化。在加熱奶油中大部分呋喃類化合物可能主要來源于美拉德反應，丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸經熱降解產生乙醛，而糖熱降解可以生成乙醇酸，乙醛和乙醇酸經過環化和脫水后發生羥醛縮合形成呋喃。天冬氨酸是加熱前奶油極性組分中含量最高的氨基酸，也是加熱后含量減少最多的氨基酸；此外，在加熱后奶油中檢測到少量葡萄糖，說明在加熱過程中呋喃的形成與乳糖和氨基酸的相互作用有關，這也解釋了乳糖和氨基酸含量的大量減少。此外，Strecker醛類含量在加熱后均有顯著增加，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛表現出類似麥芽的香氣，甲硫基丙醛則表現出類似烤土豆的香氣，這些均為焙烤食品中的特征風味化合物。2-甲基丁醛和3-甲基丁醛由異亮氨酸和亮氨酸的Strecker降解形成。此外，Amadori重排產物經過1,2-或2,3-烯醇化、脫水和水解后轉化為-羰基化合物，再與相應的氨基酸發生Strecker反應也可生成Strecker醛類。結合表1和表3分析，2-甲基丁醛和3-甲基丁醛含量的增多也與其前體物質異亮氨酸和亮氨酸含量的減少相對應。甲硫基丙醛僅存在于加熱后奶油中，且其含量相較其他關鍵香氣化合物并不高，但甲硫氨酸含量在加熱前后變化幅度很大，可能是由于甲硫基丙醛的熱不穩定性，其在加熱過程易分解成甲硫醇，進一步氧化成二甲基二硫化合物并流失。甲基吡嗪只在加熱后奶油中檢測到，其生成也是基于美拉德反應和Strecker降解，美拉德反應初期發生Amadori重排，導致包括-二羰基在內的還原酮的形成，然后Strecker降解將-二羰基轉化為-氨基羰基，進而縮合形成吡嗪。吡嗪的前體物質非常豐富，如-氨基丁酸、乙偶姻、纈氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、乙酸，這些組分都可為Strecker醛類的生成提供氨基，從而促進這類化合物的形成。由表1可知，奶油極性組分中存在許多可以提供氨基的前體物質，這些物質對美拉德反應產物的形成具有不可忽視的作用，因此奶油極性組分在加熱后含量大量減少。

揮發性短鏈脂肪酸對奶油中的奶酪香氣具有積極作用，其中丁酸對奶油香氣貢獻最大，閾值最低，僅50.5 mg/kg。由表3可知，飽和脂肪酸在未加熱奶油中含量很高，而飽和脂肪酸來自甘油三酯中脂肪酸鏈的水解，這說明在加熱前奶油中已有少量甘油三酯發生水解。此外，丁酸和其他短鏈、中鏈脂肪酸主要位于乳脂肪的-3位，而由表2可知，1,2-雙甘酯和單甘酯均在加熱前奶油中檢測到，說明甘油三酯-3位脂肪酸鏈被釋放。因此，在未加熱奶油的揮發性物質中存在較高含量的短鏈和中鏈脂肪酸。經過加熱后，飽和脂肪酸含量增加，說明甘油酯水解程度加深，因此，雙甘酯和單甘酯含量顯著減少。甲基酮對奶酪風味及牛奶味具有重要貢獻，2-庚酮和2-壬酮作為主要的特征風味化合物，其在加熱后奶油中含量增加顯著。甲基酮由飽和脂肪酸經過-氧化生成-酮酸，再經脫羧形成。奶油中含有75.87%的飽和脂肪酸，這為甲基酮的形成提供了充足的前體物質。另外，內酯也是飽和脂肪酸的氧化產物，是由羥基脂肪酸分子內酯化形成的環狀化合物，通常具有強烈的、令人愉快的感官特性，尤其是-十二內酯。內酯含量在加熱后也顯著增加。因此，甲基酮和內酯含量的大幅增加可以解釋奶油中飽和脂肪酸含量的減少。在由不飽和脂肪酸氧化而來的關鍵香氣化合物中，1-辛烯-3-酮含量增加最多，是由亞油酸在C13位發生氧化，伴隨C10和C11位鍵斷裂，然后經氫交換反應形成。己醛和(,)-2,4-癸二烯醛分別來自于亞油酸在氧化過程中C9和C13位形成的氫過氧化物，()-2-壬烯醛和壬醛分別為亞油酸和油酸的降解產物。有研究指出不飽和醛類加熱發生降解，既可被還原成醇，也可能被氧化成酸，而且這些醛類也可進一步參與美拉德反應，如2,4-癸二烯醛與氨基反應產生更多的含氮化合物，這解釋了加熱過程中醛類含量增加相對較少而不飽和脂肪酸大量減少的原因。

關鍵香氣化合物中飽和脂肪酸降解產物含量的增加幅度明顯大于不飽和脂肪酸降解產物，這是因為奶油中飽和脂肪酸含量遠高于不飽和脂肪酸，而且多不飽和脂肪酸也會促進脂質脂肪酸的自氧化。對于來源于不飽和脂肪酸的醛類和酮類，在未加熱奶油中油酸降解產生的壬醛含量雖低于亞油酸降解產生的醛類，但其在加熱后含量增加最多，且在未加熱奶油中油酸含量也為最高。這表明奶油中風味前體物質含量越高，經過加熱處理后該風味化合物含量增加越顯著。

3 結論

利用NMR和SPME-GC-MS對奶油中的主要成分和揮發性化合物進行研究，分析加熱過程中兩者的變化。結果表明，乳糖和少量的游離氨基酸、游離脂肪酸和有機酸是奶油中主要的極性組分，這些物質在加熱后大量減少，以乳糖和游離氨基酸含量減少最多；甘油三酯以及少量的雙甘酯和單甘酯為奶油中主要的非極性組分，其在加熱后含量減少相對較少。脂質來源的香氣化合物普遍存在于未加熱奶油中，經加熱后，甲基酮和內酯含量大幅增加，而短鏈脂肪酸和醛類含量的增加相對較少。美拉德反應產物含量增加最顯著，而且甲硫基丙醛、麥芽酚和呋喃酮僅在加熱后奶油中被檢測到。對加熱前后奶油中非揮發性和揮發性化合物的變化比較分析發現，加熱奶油中美拉德反應產物的形成是奶油中極性組分含量大量減少的原因，脂質來源香氣化合物含量的增加與奶油中脂肪酸含量的減少相對應，當奶油中風味前體物質含量越高，加熱后該風味化合物含量增加越顯著。本研究結果為奶油風味和產品的研究提供了理論基礎。