藏北高寒草原典型植物根際土壤細菌群落結構多樣性及根系特征分析

付莉嬌，李雪琴，范繼輝，魯旭陽，鄢 燕*

(1.中國科學院、水利部成都山地災害與環境研究所山地表生過程與生態調控重點實驗室，四川 成都 610041；2. 中國科學院大學，北京 100049)

土壤微生物是土壤中物質轉化的動力[1]，作為陸地生態系統中的重要組成成分，參與土壤有機質的分解、元素循環、土壤礦物質分解等地球化學循環過程，不僅在土壤的形成、發育和維持生態系統平衡等方面發揮著重要作用，對于改善根際土壤質量也尤為關鍵。植物依靠根系吸收土壤中的養分和水分，在植物根系周圍生活的土壤微生物為植物提供氮素等礦質營養元素以及有機酸等有機元素，從而促進植物的生長發育。同時，植被的生長發育也會對土壤微生物群落結構產生影響[2]。植物和土壤微生物的協同發展是互惠的[3]，二者皆長期受益。根際作為直接接受植物根系和分泌物影響的土壤區域，直接制約著植物對營養物質的吸收與利用。另外，根際也是微生物最活躍的區域，根際微生物通過自身代謝活動將土壤中的營養物質轉化為植物可吸收利用形態，對植物生長和抗逆性具有重要作用[4-6]。根際土壤微生物群落結構除受自身狀況(植物種類、發育階段、營養狀況等)影響以外，還受土壤理化性質(土壤類型、水分、pH、礦質元素和溫度等)影響[6-8]。例如，在鹽堿脅迫下的土壤pH和含鹽量比非鹽堿土壤高，土壤含鹽量對土壤微生物群落的結構、多樣性以及活性存在顯著的影響。在過去的研究中，人們對植物不同物候期[9]、不同季節[10]、干旱脅迫或鹽堿脅迫下[11]以及不同物種間[12]的根際土壤微生物群落結構多樣性展開了大量研究，也發現了物候、季節和鹽堿脅迫等會對植物群落結構和根際土壤微生物產生或多或少的影響。

本研究區域的季節性流水帶屬于坡面薄層水流，受地表狀況和降水強度等諸多因素影響，形成了一種特殊的水流形態。草地植被的覆蓋可以降低坡面流流速[13]，減緩坡面侵蝕進程。張圓圓等[14]通過對石羊河中下游不同河岸類型區植被和土壤的調查發現，隨著石羊河中下游部分河段的季節性斷流，植被發生了明顯退化，當水分條件和生態環境發生改變時，土壤也逐漸退化。流水帶的長期斷流和短期水蝕造成的生境變化改變了植被群落結構，造成地上部分植被單一，草地植物物種多樣性發生變化。那么對于植被地下部分，即對根系形態和根際土壤微生物群落結構又會有怎樣的影響？

16S核糖體RNA(16S rRNA)基因測序技術是一種能同時對樣品中所有微生物進行檢測并獲取微生物群落組成以及它們之間的相對豐度的高通量技術[15]，因其通量大、時間短、信息量豐富和精確度較高等特點，在微生物群落多樣性的研究方面應用愈來愈廣泛[16-18]。基于此，本研究采用高通量測序技術對流水帶內外不同植物根際土壤微生物的16S rRNA基因V3-V4片段進行擴增測序，研究流水區與對照區不同植物根際土壤細菌群落多樣性及其與土壤理化性質之間的關系，并對根系部分進行形態差異比較，以期為藏北高寒草原退化草地的修復提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究在中國科學院申扎高寒草原與濕地生態系統觀測試驗站(30°57′ N，88°42′ E，海拔4 675 m)的永久樣地內展開。樣地緊靠山地，地勢北高南低，形成一個緩坡地帶。氣候屬高原亞寒帶半干旱季風氣候區，空氣稀薄，且寒冷干燥，年均溫0.4℃，年日照時數為2 915.5 h，霜期持續天數為279.1 d，常年干旱少雨且分布不均，年降水量為298.6 mm，年蒸發量約為年降水量的9倍，而絕大部分降雨發生在每年的6—8月，在此期間由于降雨偏多和山雪融化的原因，雨水和雪水沿著地勢從高往低形成流水帶。因此本研究以該流水帶為試驗區(圖1)，非流水帶為對照區。

樣地內植被類型屬高寒草原，土壤類型為高寒草原土，優勢種為紫花針茅(Stipapurpurea)、青藏苔草(Carexmoorcroftii)和早熟禾(Poaannua)，伴生有昆侖蒿(Artemisiananschanica)、狼毒(Stellerachamaejasme)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、矮火絨草(Leontopodiumnanum) 和小葉棘豆(Oxytropismicrophylla)等。經過樣方調查后發現，紫花針茅、青藏苔草和早熟禾的植株平均高度在流水帶內分別為12.27 cm，3.5 cm和20.13 cm，對照區內分別為6.18 cm，3.0 cm和8.88 cm；植被群落蓋度在流水帶為20.67%，對照區26.67%；紫花針茅在對照區更豐富，青藏苔草和早熟禾在流水帶更常見。流水帶上的植被呈現出個體長勢茂盛、整體稀疏的特征，而流水帶外的植被雖個體弱小卻數量多。流水帶內外植被的地上生物量相近，而在流水帶外的地下生物量約為流水帶內的2倍。流水帶0～30 cm土層的土壤含水率為8.25%，對照區為7.89%，實驗地地處藏北，蒸發量大，土壤具有明顯的粗骨性特征，表層土壤含有91%的沙粒[19]，滲水速度快，保水性能差，導致流水帶內外0～30 cm土層土壤含水率差距不明顯。

1.2 樣品采集

在申扎試驗站高寒草原樣地流水帶內和流水帶外圍區域平緩地帶分別選取3種典型植物群落，青藏苔草、早熟禾和紫花針茅群落。樣方規格為3 m×3 m，挑選長勢相近且健康的植株個體10株，用鐵鍬圍繞植株垂直挖取全株樣，采用“抖根法”[20]抖去多余的大塊土壤后，用刷子掃取附在根系表面的土壤(厚度約為1 mm)，混合均勻作為根際土壤樣品。將土壤樣品放置在具有隔熱效果的自封袋內帶回實驗室，冰箱冷藏保存用于微生物群落多樣性分析，同時，全株樣樣品也置于密封袋內帶回實驗室測定根系物理性質。樣品編號為SJC、SJP、SJS、SCKC、SCKP、SCKS(中間字母J和CK分別代表流水區和對照區；末尾字母C代表青藏苔草，P代表早熟禾，S代表紫花針茅)。另外，在同一樣方內利用五點取樣法采取0～30 cm土壤混勻作為一個土壤樣品，帶回實驗室測定土壤理化性質，樣品編號同上。根際土壤每個樣品設置3個重復，根系形態特征每個樣品5次重復，共計得到18個根際土壤樣品、30個根系樣品和6個土壤樣品。

圖1 研究區位置圖(A)申扎站地理位置圖；(B)申扎站高寒草原觀測樣地谷歌衛星圖；(C)流水帶實拍圖Fig.1 Location map of the study area (A) Geographical location map of Shenzha Station;(B) Google satellite map of alpine grassland observation sample plot of Shenzha Station;(C) Actual picture of running water zone

1.3 分析方法

土壤養分測定方法如下。土壤有機質(SOM)含量采用重鉻酸鉀容量法進行測定，全氮(TN)含量采用重鉻酸鉀-硫酸硝化法測定，全磷(TP)含量采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測定，堿解氮(AN)含量的測定采用堿解擴散法，速效磷(AP)含量的測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，土壤含水量采用烘干法測定。

根系性狀測定：根系總根長、平均直徑、總表面積、總體積、根尖數等性狀采用根系掃描儀(Epson Perfection V850 Pro)測定。

根際土壤微生物群落結構多樣性測定。利用土壤DNA提取試劑盒(Mobio Soil DNA Isolation Kit)從1 g土壤樣本中提取基因組DNA，DNA提取步驟按照試劑盒說明書進行，并將提取好的DNA樣本在―80℃至―20℃冷凍保存待用。使用分光光度計(NanoDrop)檢測DNA濃度后，取1 μL DNA樣本進行PCR擴增，PCR產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其目的條帶大小。將PCR擴增產物送至深圳海一時代基因科技有限公司進行測序分析。

1.4 數據分析

采用Excel 2019對土壤養分、根系性狀、根際土壤微生物等數據進行前期處理。用QIIME軟件進行各樣品細菌多樣性(α多樣性)及各組間多樣性(β多樣性)比較分析。使用wilcoxon檢驗方法進行物種差異檢驗分析，用MRPP分析方法比較組間群落結構差異是否顯著。各處理下的根系形態特征指標利用WinRHIZO根系圖像分析系統軟件進行分析，并運用SPSS 25.0統計軟件進行t檢驗，分析3種植物在流水帶內外的根系形態特征差異(顯著性水平設為0.05)。以根際土壤微生物群落在門水平上的相對豐度數據作為物種數據，以土壤理化因子作為環境因子數據，使用Canoco 5.0版本軟件進行冗余分析(RDA)。并通過Pearson相關分析來探討根系形態與根系土壤微生物之間的關系。

2 結果與分析

2.1 不同植物根際土壤菌群總體情況

根據門水平Top 15物種相對豐度柱形圖(圖2)，將相對豐度排名低于十五的細菌歸為Others后，流水區與對照區3種不同植物根際土壤細菌排名前十五的門類分別是：Acidobacteria(酸桿菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Thaumarchaeota(奇古菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門)、Tectomicrobia(護微菌門)、Saccharibacteria(單糖菌門)、Cyanobacteria(藍藻細菌)、FBP。其中，Acidobacteria(酸桿菌門)為豐度最大的門類，是所有樣本中的優勢細菌，占所有門類的25%左右，在6個根際土樣本中的分布規律為SJS>SJP>SCKC>SCKS>SCKP>SJC。Firmicutes在SCKC根際土組中豐度最大，約為SCKS根際土組的26倍。

圖2 門水平Top 15相對豐度柱形圖Fig.2 Relative abundance histogram of Top15 species at phylum level

使用wilcoxon檢驗方法對門水平Top 15物種進行差異檢驗分析(表1)，結果顯示，每種植物的根際土壤微生物門類在流水帶內外沒有顯著差異。

表1 門水平Top15物種間wilcoxon檢驗表Table 1 Wilcoxon test of Top15 species at phylum level

2.2 不同植物根際土壤的生物多樣性差異分析

2.2.1α多樣性 基于Shannon指數、Chao 1指數、物種豐富度指數和譜系多樣性指數繪制的Alpha多樣性小提琴圖(圖3)，SJC根際土組樣本生物多樣性高于SCKC根際土組樣本；SJP根際土組樣本生物多樣性高于SCKP根際土組樣本；而SJS根際土組樣本生物多樣性低于SCKS根際土組樣本。并且SJC與SCKC、SJP與SCKP、SJS與SCKS土壤細菌之間差異均顯著(P<0.05)。綜上，流水帶紫花針茅和青藏苔草根際土組的細菌多樣性和豐富性均高于對照組，而流水帶早熟禾根際土組的細菌多樣性和豐富性是低于對照區的。

圖3 α多樣性小提琴圖Fig.3 α Violin Pictures of Diversity

2.2.2β多樣性 基于OTU水平的主坐標分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)顯示(圖4)，與根際土壤細菌相關的2個主成分累計貢獻率達53%，PC1和PC2分別可解釋總變異量的36%和17%。SJC、SCKC與SJS位于同一象限內且距離較近，距離較近代表它們的細菌群落結構相似；SJP和SCKP距離也較近，說明其群落結構相似；而SCKS距離其他5個樣本距離較遠，因而表明SCKS的細菌群落結構與其余5個樣本存在較大差異。每組樣品的細菌群落都位于同一象限內且距離很近，說明每組樣品具有很強的聚類性，組內微生物群落結構差異相對較小。

2.2.3組間群落結構差異顯著性分析 基于組內和組間差異的MRPP(multi response permutation procedure)分析顯示(表2)，流水帶內外青藏苔草組、早熟禾組和紫花針茅組的expect delta值均大于observe delta值，表明組間差異均大于組內差異，但都不顯著。

2.3 土壤養分與根際土壤微生物群落結構的相關分析

根據所有解釋變量(包括土壤含水量、有機質SOM、全氮TN、全磷TP、堿解氮AN、速效磷AP)的前向選擇結果，選擇部分環境因子(SOM、TP、AP)與流水帶內外3種典型植物根際土壤微生物群落結構之間的關系進行冗余分析(Redundancy analysis，RDA，圖5)。環境變量對響應變量總解釋率為65.7%，其中RDA1和RDA2對響應變量的貢獻率分別為48.21%和12.82%，物種和環境因子的相關性分別為0.935和0.779。SJC與SCKC之間根際土壤微生物群落結構差異不顯著，SJS與SCKS、SJP與SCKP之間微生物群落結構差異較大，且3種植物種間的根際土壤微生物群落結構差異顯著。環境因子AP對根際土壤微生物群落結構有顯著影響(P<0.05)，TP和SOM對微生物群落結構影響不顯著。AP與Bacteroidetes、Firmicutes有較強的正相關關系，與Verrucomicrobia和Nitrospirae呈顯著負相關關系；TP與Saccharbacteria、Proteobacteria、Thaumarchaeota、Acidobacteria呈負相關，而與Chloroflexi呈正相關；SOM與Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Nitrospirae、Actinobacteria呈正相關關系。

圖5 根際土壤微生物群落結構與環境因子的RDA分析Fig.5 Redundancy analysis of rhizosphere soil microbial community structure and environmental factors注：SOM,土壤有機質；TP,全磷；AP,速效磷Note:SOM,soil organic matter;TP,total phosphorus;AP,available phosphorus

2.4 流水帶內外植物根系形態差異

流水帶內外3種植物間的總根系形態特征存在一定差異(表3)。在青藏苔草組中，流水帶組與對照組在根尖數上存在差異，SCKC顯著高于SJC(高80.18%)，根尖數達到409個，而在總根長、總表面積、平均直徑和根系總體積之間差異不顯著；早熟禾組中，總表面積、平均直徑和根系總體積都表現出SJP>SCKP，分別為15.04 cm2，0.82 mm，0.32 cm3，而根尖數表現為SCKP>SJP，為282個；在紫花針茅組中，總根長與根尖數表現一致為SCKS顯著高于SJS，分別高出77.26%，29.52%，平均直徑則表現為SJS顯著高于SCKS(高37.21%)。此外，根尖數在青藏苔草、早熟禾和紫花針茅中都表現為對照組顯著高于流水帶組(P<0.05)。

表3 流水帶內外3種植物根系形態特征比較Table 3 Comparison of root morphological characteristics of three plants inside and outside the running zone(mean±SE)

2.5 根系形態與根際土壤微生物群落結構的相關分析

Pearson相關分析結果(表4)表明，Gemmatimonadetes與總根長和根系總表面積、Planctomycetes與總根長之間呈顯著正相關關系(P<0.05)，Actinobacteria與根尖數呈顯著負相關關系(P<0.05)，且相關系數均大于0.8，表明這些指標之間存在極強的相關關系。

表4 根系形態與根際土壤微生物的Pearson相關分析Table 4 Pearson correlation analysis between root morphology and rhizosphere soil microorganisms

3 討論

3.1 根際土壤細菌群落結構差異分析

根際是在不同植物種類、土壤和環境條件下形成的土壤-根系-微生物互作微區域，這一微生態系統中的許多化學變化和生物化學過程不同于普通的土體土壤，這些過程對植物的生長發育、營養物質的吸收與利用、微生物的生存等有直接影響作用[21]。本研究位于常年圍封的永久樣地內，未受到放牧和人為干擾，對流水帶內外3種典型植物的根際微生物群落進行測序分析之后發現，在門水平上，Acidobacteria(酸桿菌門)的豐度最大，達到25%左右，這與Liles等[22]的研究結果一致，其次是Proteobacteria(變形菌門)(圖2)。有研究表明[23]，當森林土壤被擾動后，變形菌門的豐度大于酸桿菌門，而在未受擾動的原始森林土壤中，酸桿菌門的豐度大于變形菌門。這與本研究結果相似，不同之處在于Ward等[23]的研究對象為森林土壤，而在本研究中為草原土壤。Smit等[24]的研究發現，當酸桿菌門與變形菌門的比值大于1時，土壤中的養分處于一個較低水平。因此，推測酸桿菌門豐度大于變形菌門的原因可能是由于酸桿菌門生長緩慢，一旦土壤結構發生改變，土壤營養隨之變化，此時生長較快的微生物便會取代寡營養生長方式的酸桿菌門。在本研究中，相對豐度排名靠前的酸桿菌門、放線菌門和變形菌門在Fierer等[25]的研究中被認為是貧營養型細菌，主要負責分解深層土壤中的頑固性碳。

影響根際土壤微生物多樣性的因素是多元的，包括草地不同利用方式[26]、土壤類型[27-28]、植物類型等等。在本研究中，wilcoxon物種差異檢驗結果表示3種植物組內沒有顯著差異(表1)，并在PCoA分析中得到驗證，即組內微生物群落結構差異較小。MRPP分析結果顯示3種植物組間差異大于組內差異，但是不顯著(表2)，推測組內差異和組間差異不顯著的原因可能是由于生物學重復樣本量不足造成的。可見，在本研究中造成3種典型植物組內微生物群落沒有顯著差異且組間差異大于組內差異最可能的原因是由于植物種類的不同，而不是不同的采樣區。

3.2 根際土壤微生物群落結構與環境因子的關系

研究表明[29-30]，土壤理化性質的變化，例如土壤pH、有機質、全氮、全磷、速效鉀、速效磷等含量的改變，會引起植物根際區域微生態環境的改變，對植物根際土壤微生物群落結構多樣性和植物的生長發育產生影響。磷(P)是植物生長和進行主要代謝過程所必需的大量營養元素，也是影響植物生產力的限制性因子[31]。在本研究中，影響根際土壤微生物群落結構及其多樣性的關鍵因子是AP(圖5)。張永亮等[32]的研究發現牧草的生長會消耗土壤較多的速效磷，而土壤中較低的速效磷水平往往是植物生長的主要限制因素[33]。紫花針茅和早熟禾在流水帶外的根際速效磷含量高于流水帶內，推測可能是由于雨季徑流的沖刷和滲透作用將養分帶向下游流水帶或更深的土層[34]，而AP含量在青藏苔草組表現為流水帶內大于流水帶外，推測可能是因為植物類型的不同。不同的植物對土壤速效磷的需求量不同，同時對根際微生物的“招募”作用可能存在物種偏好性[35]。這在本研究中得到了驗證，AP與Bacteroidetes呈顯著正相關關系，Bacteroidetes相對豐度與AP含量規律一致，表現為SJC>SCKC，SJP

3.3 流水帶內外植物根系形態分析

根系作為連接土壤與植物的載體，其形態特征的變化直接關系著植物對土壤養分和水分的吸收與利用，還會影響植物向地下生態系統輸入有機物[38-39]。在本實驗中發現，流水帶內的植物根系形態與流水帶外相比差異較為顯著。紫花針茅流水帶外的根系長度顯著高于流水帶內，根系平均直徑則表現為顯著低于流水帶外，可能是由于流水帶外表層土壤水分含量較低，植物根系需要主動吸收深層土壤中的水分用以維持其生命活動[40]。此時根系長度增加[41]，根系直徑減小，根系吸水阻力隨之減小，植物能夠最大程度的獲得深層土壤中的水分用以維持生長。丁紅等[42]認為在干旱的生境下，較長的根系和較大的根系體積和表面積更有利于植物大范圍的吸收與利用土壤中的水分和養分。韓志順等[43]對不同品種的紫花苜蓿進行干旱脅迫控制實驗發現，干旱脅迫下植物通過改變根系長度、直徑、表面積、體積等形態特征來提升自身的抗旱性。3種植物的根系平均直徑均表現為流水帶內大于流水帶外，推測根系直徑越小其活力越高，使得植株耐旱性更強。Fitters等[44]的研究表明，相對濕潤條件下的植物會通過提高光合作用來提高凈初級生產力，這也會向根系輸入更多的碳，進一步使根系直徑變大。而根尖數與根系直徑截然相反，均表現為流水帶外顯著高于流水帶內，推測在相對干旱的生境條件下，根系的基礎代謝功能增強，誘發根系生長出大量的側根和根毛，迫使植物通過增大與土壤的接觸面積來獲取生長所需的水分[45]。另外，根系不僅與植物有直接聯系，還能對根際微生物產生作用，并通過根際分泌物誘導菌群繁殖和抑制致病菌的生長[46]。Pearson相關分析顯示，根尖數與Actinobacteria顯著負相關，推測根尖可能會分泌某些物質抑制Actinobacteria的生長。因此，如果想要對根際微生物與根系形態之間的關系有更全面的了解，還需要進一步探究根際分泌物對根際土壤微生物的影響機制。

4 結論

本研究通過對流水帶內外3種典型植物的細菌群落與根系形態特征進行分析，主要得出以下結論：3種植物的根際土壤微生物門類在流水帶內外沒有顯著差異，Acidobacteria(酸桿菌門)為所有樣本中的優勢菌門，并且組間差異均大于組內差異，但不顯著，在一定程度上說明了不同類型的植物是造成根際土壤微生物群落結構差異的原因。流水帶內外3種植物間的總根系形態特征存在一定差異，根系平均直徑一致表現為流水帶組大于對照組，根尖數則表現為對照組顯著高于流水帶組，說明植物會通過各自獨特的生存策略來調整根系形態以適應不同的生境條件。在測定的土壤環境因子中，速效磷是影響根際土壤微生物群落結構及其多樣性的關鍵因子，因此，速效磷可以作為預測藏北高寒草原上根際土壤微生物群落結構與功能的關鍵指標。