FKBP1B在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

張少森 鞠久君 朱雪潔 王彩霞

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的最主要原因。2020年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中，乳腺癌目前已經(jīng)成為全球發(fā)生率最高的癌癥[1]。乳腺癌目前最主要的治療方法仍然以手術(shù)切除為主，因此尋找特異性靶向治療藥物對(duì)乳腺癌的防治具有重要意義[2]。

FK506結(jié)合蛋白1B(FK506 binding proteins 1B，F(xiàn)KBP1B)是FKBPs家族中的一員[3]。FKBP是肽基-脯氨酰順式/反式異構(gòu)酶 (PPIases)，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)中的脯氨酸從順式構(gòu)型轉(zhuǎn)化為反式構(gòu)型，是一種廣泛分布且系統(tǒng)發(fā)育保守的非淋巴特異性蛋白，存在于許多真核生物中[4]。FKBP屬于親免素家族，可以與FK506、雷帕霉素、環(huán)孢菌素等免疫抑制藥物結(jié)合，參與腫瘤發(fā)生和化療耐藥等多個(gè)過程[5, 6]。FKBPs通過特定的蛋白相互作用以及伴侶蛋白的作用執(zhí)行多種生理功能[7]。很多研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP家族成員在多種腫瘤中異常表達(dá)，且抑制FKBPs有明顯的增加細(xì)胞凋亡的作用，使得FKBP家族成員成為新的可能的腫瘤靶點(diǎn)[8～12]。作為FKBP1B的類似物，F(xiàn)KBP12被報(bào)道能夠調(diào)控TGF-β信號(hào)[13]。然而FKBP1B在腫瘤中的表達(dá)情況以及其對(duì)腫瘤發(fā)展的影響尚未可知。

本研究檢測(cè)了不同惡性程度的乳腺癌組織和乳腺癌癌旁組織中FKBP1B的表達(dá)情況，以及不同惡性程度的乳腺癌細(xì)胞系中FKBP1B的表達(dá)量。本研究在低度惡性的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中過表達(dá)FKBP1B，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別評(píng)價(jià)FKBP1B對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移的影響，并用Western blot法探討其可能的作用機(jī)制，旨在為研究FKBP1B在乳腺癌發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)，為乳腺癌的診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.主要試劑:DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)維森特公司；10%的胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。Turbo轉(zhuǎn)染試劑和Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。免疫印跡和免疫組化用FKBP1B抗體和免疫印跡化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin購(gòu)自中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，HRP偶聯(lián)抗兔和抗小鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。PCR引物在睿博生物有限公司合成，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)天根生化科技(北京)有限公司；qPCR SuperMix購(gòu)自中國(guó)北京全式金公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和蛋白marker購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，PVDF膜、8.0μm的Millicell 懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室和超濾管購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒 CCK8(cell counting kit-8)購(gòu)自日本Dojindo公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞均購(gòu)自國(guó)家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫(kù)。用含有100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，10% FBS的DMEM培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在含有5% CO2的37℃恒溫細(xì)胞箱中培養(yǎng)。通過慢病毒感染的方法構(gòu)建FKBP1B過表達(dá)MCF-7細(xì)胞系。將包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG和包含有FKBP1B的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLentiCMV按照3∶1∶4的比例共同轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中。72h后，細(xì)胞上清用0.45μm濾膜過濾，加入到MCF-7細(xì)胞中。其中病毒的效價(jià)為1×108U/ml，侵染細(xì)胞時(shí)病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)為50。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，向細(xì)胞中加入殺稻瘟菌素進(jìn)行篩選。過表達(dá)引物上游引物：5′-ATTCTAGAATGGGCGTGGAGATCGAGACCATCTCC-3′，下游引物：5′-ATGGATCCTCACTCTAAGTTGAGCAGCTCCACGTCAAAGA-TGAG-3′(下劃線標(biāo)注處為酶切位點(diǎn))。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞FKBP1B的表達(dá):利用TRIzol法提取MCF-7細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR的程序按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。以GAPDH作為內(nèi)參，測(cè)定FKBP1B的相對(duì)表達(dá)量，采用2-ΔΔ Ct法進(jìn)行分析。FKBP1B引物序列上游引物：5′-CTGACCTGCACCCCTGATG-3′，下游引物：5′-GGTGGCATTGGGAGGGATG-3′。GAPDH引物序列上游引物：5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′，下游引物：5′-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3′。

4.Western blot法檢測(cè):收取各組細(xì)胞，對(duì)照組(NC)、空載體組(control vector)、過表達(dá)FKBP1B組(FKBP1B-OE)。加入裂解液，煮樣后，進(jìn)行SDS-PAGE，后于4℃條件下將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，牛奶室溫封閉30min，用稀釋好的抗體4℃孵育過夜，TBST清洗3遍后，用相對(duì)應(yīng)的二抗孵育1h，ECL發(fā)光法顯影。

5.CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性: 種植1×103個(gè)/(100微升·孔)的細(xì)胞到96孔板。每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)平行復(fù)孔。48h后，取出96孔板，棄去細(xì)胞上清液。將CCK-8(cell counting kit-8)試劑與空的DMEM按照1∶10的比例混合。將配置好的 CCK-8 試劑以100微升/孔的量加入待測(cè)細(xì)胞中，同時(shí)做4個(gè)空白對(duì)照。將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2h后，在450nm條件下用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)值。

6.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力:將空載體組(control vector)和過表達(dá)FKBP1B組(FKBP1B-OE)細(xì)胞按5×104個(gè)/(200微升·孔)的細(xì)胞進(jìn)行稀釋。8μm的Transwell小籃裝在24孔板中，下層加入600μl含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。上層加入200μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞在小籃中培養(yǎng)48h后，將24孔板取出。棄去原培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛室溫固定30min。PBS清洗后，加入結(jié)晶紫染色，室溫放置1h。用棉簽把小籃內(nèi)部的細(xì)胞和基質(zhì)膠擦去并充分清洗，放置在盛有PBS緩沖液的24孔板中。在顯微鏡下拍照。

7.IHC檢測(cè)臨床樣本中FKBP1B的表達(dá):將購(gòu)買的切片放置在60℃烘箱中烘烤 20min 進(jìn)行脫蠟處理。將石蠟切片依次放入二甲苯以及不同濃度的乙醇中進(jìn)行水化處理。檸檬酸緩沖液修復(fù)， 3%的雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。山羊血清封閉后，F(xiàn)KBP1B抗體4℃過夜。PBS清洗后，HRP標(biāo)記的二抗孵育。加入DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用不同濃度乙醇溶液進(jìn)行脫水處理。封片后顯微鏡下拍攝不同視野。

結(jié) 果

1.不同惡性程度的乳腺癌組織和癌旁組織FKBP1B的表達(dá)情況:免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP1B的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1)，且FKBP1B的表達(dá)量隨著乳腺癌的惡性程度的增加而升高。腫瘤組織中的FKBP1B表達(dá)量明顯高于正常組織(P<0.001)；對(duì)69位腫瘤患者進(jìn)行TNM分期后分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期患者FKBP1B表達(dá)主要集中在0級(jí)和1級(jí)，Ⅱ期患者主要集中在1級(jí)和2級(jí)，Ⅲ～Ⅳ期患者主要集中在2～3級(jí)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者的FKPB1B的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，表1)。

圖1 免疫組化檢測(cè)FKBP1B在不同惡性程度的乳腺癌及正常乳腺癌組織中的表達(dá)根據(jù)FKBP1B的表達(dá)情況，從少到多分為0、1、2、3級(jí)。圖示為陰性對(duì)照(A、B)，F(xiàn)KBP1B在0級(jí)(C、D)，1級(jí)(E、F)，2級(jí)(G、H)和3級(jí)(I、J)的代表圖片。病理切片為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后，蘇木精復(fù)染

表1 FKBP1B在不同惡性程度的乳腺癌及正常乳腺癌組織中的表達(dá)情況(n)

2.不同乳腺癌細(xì)胞系中FKBP1B表達(dá)情況:與低惡性程度乳腺癌細(xì)胞系MCF-7比較，高惡性程度的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的FKBP1B的mRNA水平明顯增加(圖2A)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，MDA-MB-231中FKBP1B的蛋白表達(dá)水平明顯高于MCF-7(圖2B)。

圖2 不同惡性程度的乳腺癌細(xì)胞中FKBP1B的mRNA和蛋白表達(dá)水平A.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中FKBP1B的表達(dá)量；B.免疫印跡檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中FKBP1B的表達(dá)量，β-actin作為內(nèi)參

3.過表達(dá)FKBP1B促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖:在MCF-7中過表達(dá)FKBP1B，免疫印跡顯示過表達(dá)組FKBP1B的蛋白水平明顯高于對(duì)照組(圖3)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，過表達(dá)FKBP1B的MCF-7細(xì)胞的增殖速率明顯增加(圖4)。

圖3 Western blot法檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞中FKBP1B的蛋白水平

圖4 CCK-8檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞增殖活性

4.過表達(dá)FKBP1B對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響:遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，過表達(dá)FKBP1B后的MCF-7的遷移率顯著增加(圖5)。

圖5 過表達(dá)FKBP1B促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移(×200)A.Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)代表圖片;B.Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

5.FKBP1B促進(jìn)Hsp90α的分泌:免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)KBP1B在MDA-MB-231中的表達(dá)水平高于MCF-7；同時(shí)，MDA-MB-231的胞外Hsp90α顯著高于MCF-7(圖6)，而兩個(gè)細(xì)胞中的胞內(nèi)Hsp90α沒有顯著變化。此外，在MCF-7中過表達(dá)FKBP1B能夠顯著促進(jìn)Hsp90α的分泌(圖7)，但不影響胞內(nèi)Hsp90α的含量。

圖6 乳腺癌細(xì)胞中FKBP1B的表達(dá)與胞外HSP90α(eHSP90α)的分泌的相關(guān)性

圖7 過表達(dá)FKBP1B 促進(jìn)HSP90α的分泌

討 論

乳腺癌是女性惡性腫瘤的第一大殺手[14]。目前乳腺癌的治療主要以外科手術(shù)切除為主，以化療為輔助手段。然而化療對(duì)人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)非常大[15]。盡管免疫療法以及多種乳腺癌標(biāo)志物正在被探索，但仍然缺乏有效的用于臨床的靶點(diǎn)和標(biāo)志物[16,17]。因此，急需探索乳腺癌發(fā)展的分子機(jī)制，尋找輔助篩查的標(biāo)志物和潛在的分子靶標(biāo)。

FKBP家族成員分布廣泛，被報(bào)道能夠調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素信號(hào)、經(jīng)典和非經(jīng)典NF-κB信號(hào)、mTOR/Akt信號(hào)和TGF-β信號(hào)[18]。近年來(lái)，大量的文章報(bào)道FKBP家族的蛋白與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。其中，F(xiàn)KBP11能夠通過p53促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)生[19]。FK506結(jié)合蛋白5(FK506-binding protein 5，F(xiàn)KBP5)被報(bào)道促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展[20]。FKBP10能夠調(diào)控蛋白翻譯從而影響肺癌以及消化道腫瘤的發(fā)展[21, 22]。靶向FKBP12能夠增強(qiáng) TGF-β信號(hào)并且刺激慢性淋巴細(xì)胞白血病的凋亡[23]。然而作為FKBP家族的一員，F(xiàn)KBP1B在腫瘤中的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與正常乳腺癌組織比較，乳腺癌組織中的FKBP1B表達(dá)明顯較高，且FKBP1B在乳腺癌組織中的表達(dá)量隨惡性程度的增加而增加。與低度惡性的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7比較，高度惡性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的FKBP1B的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增多。該結(jié)果表明，F(xiàn)KBP1B的表達(dá)與乳腺癌的惡性程度相關(guān)。為了進(jìn)一步探索FKBP1B是否影響了乳腺癌的發(fā)展，筆者在MCF-7中過表達(dá)FKBP1B，通過CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FKBP1B促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

筆者前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胞外Hsp90α與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)且能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231的胞外Hsp90α含量明顯高于MCF-7，與FKBP1B的趨勢(shì)一致。因此推測(cè)FKBP1B可能通過促進(jìn)Hsp90α的分泌促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FKBP1B后，胞外Hsp90α明顯增多。此外，F(xiàn)KBP家族的FKBP51和FKBP52被報(bào)道能夠與Hsp90形成復(fù)合物，從而影響腫瘤的發(fā)展[18]。FKBP家族的FKBP38也被報(bào)道能夠與Hsp90作用從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡。這些報(bào)道進(jìn)一步佐證了FKBP家族蛋白與Hsp90的親近關(guān)系。

綜上所述，本研究表明FKBP1B在乳腺癌中的表達(dá)隨惡性程度的增高而增多，過表達(dá)FKBP1B能夠明顯的促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并且能夠增加Hsp90α的分泌。提示FKBP1B可能通過促進(jìn)Hsp90α的分泌從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展，但其相關(guān)機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。