液體活檢在胃癌診療中的研究進展

蔣 婷 王 平 黃新恩

2020年全球有超過108萬新發胃癌病例，約77萬死亡病例，且胃癌發生率還在不斷上升[1]。由于胃癌癥狀的非特異性和篩查條件限制等原因，多數患者確診時已發展至晚期，錯過了最佳治療時機。因此，選擇并開發合適的早期胃癌的篩查方法成為當前刻不容緩的問題。目前胃癌應用于臨床的篩查方法包括幽門螺桿菌血清學、血清胃蛋白酶原檢測、間接上消化道系列和內鏡檢查，但這些方法都有其局限性[2]。例如，作為診斷胃癌的金標準，上消化道內鏡結合病理活組織檢查較易發生穿孔、出血等風險。現在臨床上胃癌早期檢測最常用的腫瘤標志物包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)199、CA724、CA125、CA242、CA50，以及胃蛋白酶原和甲胎蛋白(AFP)。然而，這些傳統的腫瘤標志物的特異性和敏感度欠佳，到目前為止，沒有一種是胃癌診斷所特有的。

近年來，由于液體活檢較傳統組織活檢具有操作簡便、非侵入性、可以動態觀察等優勢而日益受到關注。液體活檢的對象原則上是任何可能含有腫瘤遺傳物質的體液樣本，例如血液、尿液、唾液或腦脊液等，其中以血液樣本的研究最為廣泛。液體活檢主要檢測循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)、循環腫瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、外泌體、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及微囊泡等。本文概述了液體活檢在胃癌早期診斷、治療、預后中的潛在臨床應用，以及臨床常規實施液體活檢前仍需克服的障礙。

一、液體活檢技術

液體活檢是指對循環腫瘤細胞、細胞外囊泡、核酸等生物液體進行取樣，并對其基因組或蛋白質組學進行評估。隨著微流控芯片的細胞分離技術及分子檢測技術的發展創新，如下一代測序(next generaton sequencing，NGS)和液滴數字聚合酶鏈反應(droplet digital PCR，ddPCR)，基于液體活檢的個性化醫療有望逐步成為現實。對于臨床醫生來說，液體活檢可用于篩查并診斷癌癥、評估預后、確定治療靶點、預測治療的有效性、監測腫瘤負荷和治療耐藥性等多個方面[3]。通過非侵入性技術在不同的生物體液中測定和鑒定生物學標志物，液體活檢已被證明可有效應用于不同類型的腫瘤，包括肝癌、肺癌、結腸直腸癌、黑色素瘤和胰腺癌等，但是在胃癌中的研究較少[4]。

二、液體活檢常用生物學標志物

1.CTCs：CTCs起源于原發性和轉移的癌性病變，和形成新的遠處轉移相關,因此在疾病進展中發揮著關鍵的作用。CTCs最常用的細胞病理學定義是: 這是一種具有圓形或卵形形態的細胞，胞質內可見圓形或卵形核，與其他血細胞的區別在于其上皮標志物包括上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecules, EpCAM)和細胞角蛋白(cytokeratin, CK)的陽性表達以及白細胞特異性標志物CD45的陰性表達[5]。CTCs在形態學上分為兩類，即單一CTCs和簇狀CTCs。癌癥轉移通常是通過簇類CTCs發生的，因此臨床生物學標志物如腫瘤標志物和放射診斷特征是為檢測簇類CTCs的替代標志物[6]。CTCs通常在每毫升外周血中少于一個單位，因此血液中CTCs的檢測需要敏感度、特異性和可重復性高的方法。免疫細胞化學、RT-PCR、流式細胞術和半自動化免疫磁分離系統(CellSearch)均已用于檢測CTCs。CellSearch是目前唯一獲得美國FDA批準的CTCs分離設備。CTCs檢測對癌癥患者預后的試驗表明，大量的CTCs與治療反應差、總體生存期縮短、疾病侵襲性、轉移增加、復發時間減少相關[7]。

2.ctDNA：在腫瘤的發生和進展過程中，細胞凋亡或壞死以及外泌體可能會釋放細胞游離DNA (cfDNA)到血液中，而來源于腫瘤的cfDNA，又稱循環腫瘤DNA (ctDNA)。ctDNA是存在于血漿或血清中的單鏈或雙鏈DNA。早期研究表明，ctDNA具有許多與腫瘤相關的分子特征，如單核苷酸突變、甲基化變化和腫瘤衍生序列等[8]。推測ctDNA是通過易感細胞的致瘤轉化而分泌的信號分子，驅動腫瘤轉移。已有研究發現，通過結合ctDNA與蛋白質生物標記，單一檢測可以篩查多種癌癥類型。一般來說，ctDNA的使用提供了一種成本效益高、敏感度高的工具，是一種具有潛在臨床應用價值的微創方法，包括以下幾種：①早期癌癥篩查;②檢測治療效果;③識別治療靶點;④評估預后和腫瘤復發情況;⑤實時評價耐藥[9]。

3.miRNA：microRNAs是一類長度為18～24個核苷酸的小分子非編碼RNA (ncRNA)，通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(3′-utr)結合，在轉錄后調控基因表達，導致其翻譯抑制或降解。miRNAs是信號通路的調節因子，因此參與了腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和遷移等多種過程。目前，有許多與胃癌發展相關的microRNA已被鑒定，其中一些與Wnt/β-catenin、PI3K/Akt/mTOR、RAS/RAF/EKK/MAPK、NF-κB、TGF-β和JAK/STAT信號通路的關系被追蹤。一些miRNA在細胞過程中具有多向作用。根據已發表的數據分析，發現與轉移相關的miRNA最常與Wnt/β-catenin通路相互作用，或在與其他通路相互作用時影響激活EMT的基因。在大多數情況下，與化療耐藥性相關的miRNA作用于凋亡調節因子，并與PI3K/Akt/mTOR通路相關[10]。與蛋白質或lncRNA比較，miRNA具有耐核糖核酸酶降解和在生物樣品中穩定性高的特點，是生物學標志物研究領域中具有吸引力的靶點。

4.外泌體：外泌體是一種直徑為30～140nm的膜結合顆粒，起源于大型多泡體(MVBs)。外泌體可通過MVBs與質膜融合釋放到細胞外環境中,也可以大量釋放在各種生物液體中，如血漿、尿液、唾液、腹腔積液和支氣管肺泡灌洗液。目前外泌體的提取方法分為微分超離心法、密度梯度/緩沖離心法、尺寸排斥層析法、沉淀法、免疫親和捕獲法、微流控法等，其中微分超離心法因其提取純度較高為研究者最常用的方法[11]。與其他液體活檢來源比較，外泌體具有顯著的優勢，如穩定性高、易于鑒別、獲取方便、診斷準確性高等。最初人們認為外泌體只參與去除不必要的分子，但此后許多研究闡明了外泌體在腫瘤進展和轉移中的復雜功能。外泌體可以呈現親本細胞甚至靶細胞的特異性表面蛋白，從而實現起源特異性外泌體的分離，并預測器官特異性轉移[12]。與CTCs和ctDNA比較，腫瘤外泌體作為預后和治療指導生物學標志物主要取決于其蛋白和miRNA表達譜。因此，鑒于外泌體在細胞-細胞通信和腫瘤特異性內容方面的關鍵作用，外泌體是一種很有前途的生物學標志物，可用于早期腫瘤檢測、監測和藥物治療計劃。

三、液體活檢在胃癌診療中的臨床應用

1.早期篩查及診斷：Kang等[13]納入了116例接受胃切除術的胃癌患者和31例健康志愿者，在胃切除術前采集外周血，采用離心微流控系統檢測CTCs，結果發現當CTCs水平為2個單位/7.5ml時，區分胃癌與健康對照組的敏感度和特異性分別為85.3%和90.3%，且超過80%的早期(T1或N0)胃癌患者可檢測到CTCs。在另一項研究中，使用一種新型楔形微流控芯片檢測到胃癌患者2ml外周血中CTCs的陽性率為75%。在此項研究中，CTCs被證實與腫瘤分化、淋巴血管浸潤和分期有關[14]。因此，CTCs檢測作為胃癌早期診斷的生物學標志物具有潛在的價值。有研究確定了3種特異性的miRNAs: hsa-miR-320a、hsa-miR-1260b和hsa-miR-6515-5p，它們在胃癌患者的血清樣本中顯著高表達，具有高敏感度，為胃癌的診斷提供了一種新的簡單而有效的方法[15]。Chen等[16]研究發現，循環miRNA-196a可以區分癌前病變、低級別瘤變、高級別瘤變和早期胃癌患者與健康對照組，特別是健康參與者與胃發育不良和早期癌癥患者。目前還沒有針對胃神經內分泌腫瘤(gastric neuroendocrine neoplasms,g-NENS)的循環診斷生物學標志物，Dou等[17]研究發現，miRNA-202-3p在1型g-NENS腫瘤組織中過表達，用實時熒光定量PCR檢測受試者血清中的miRNA-202-3p水平，發現患者組表達水平明顯高于對照組，敏感度和特異性分別為88.9%和77.8%，提示miRNA-202-3p對診斷 1型g-NENS具有潛在價值。但是miRNA-202-3p是神經內分泌細胞增生的生物學標志物還是神經內分泌腫瘤的特異性生物學標志物還需要進一步的研究[17]。此外，血漿外泌體lncUEGC1在區分Ⅰ期胃癌患者與健康人群或癌前病變方面的診斷價值高于血清CEA，提示外泌體可能是一種高敏感、無侵襲性的胃癌診斷生物學標志物[18]。

2.指導治療：Wang等[19]研究證明了縱向ctDNA測序有望預測曲妥珠單抗治療下HER-2陽性轉移性胃癌患者的腫瘤收縮和進展，從而為耐藥的基因改變提供新的思路。Zhang等[20]報道了胃癌患者中miR-939水平與局部復發、遠處轉移和化療耐藥呈負相關，同時進一步的功能研究表明，miR-939的過表達抑制胃癌細胞生長，并通過抑制細胞生長和誘導細胞凋亡來增強5-氟尿嘧啶誘導的化療敏感度。Fan等[21]研究發現，Cbl原癌基因B (Cbl-b)作為miR-940相互作用的泛素化信號轉換器和轉錄激活因子5a (STAT5a)的靶基因，下調STAT5a和抗程序性死亡配體-1 (PD-L1)的表達，而miR-940/Cbl-b/STAT5a/PD-L1軸促進胃癌細胞的增殖和遷移，所以類似的研究可能為胃癌基于miRNA的免疫治療提供一些新思路。外泌體被認為是基于RNA的治療策略的高效運載工具，因此外泌體已被用于運送生物分子和用于癌癥治療。體外實驗表明，外泌體中裝載的anti-miR-214能與細胞融合，調控潛在靶點，降低細胞活力，抑制遷移，促進細胞凋亡。由于腫瘤中miR-214的下調和對靶蛋白的過表達，尾注射anti-miR-214可在體內逆轉胃癌對DDP的化療耐藥并抑制腫瘤生長，提示這可能是治療順鉑難治性GC的一種替代方法[22]。抗癌蛋白也可以通過外泌體傳遞并發揮腫瘤抑制作用。有研究證實，胃上皮分泌并內化了攜帶抑癌GKN1蛋白的外泌體，可抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，從而抑制胃腫瘤的發生，這表明其在胃癌治療中的臨床應用[23]。

3.評價治療效果:研究表明，ctDNA可能是一個有用的術后標志物，并可以指導輔助治療，且化療后的ctDNA狀態與手術后的疾病狀態有更強的相關性，并有可能為進一步的治療提供信息[24]。在Liu等[25]開展的研究中，基線CTC數量少或化療第1個周期后CTC計數下降的晚期胃癌患者可能從姑息性化療中獲益顯著，同時低CTC計數(≤2個單位/5ml外周血)的患者與高CTC計數(>2個單位/5ml外周血)的患者比較，中位無進展生存期和中位總生存期(median overall survival，mOS)明顯更長[25]。因此，CTCs計數可作為一個良好的化療監測指標和理想的預后指標。一項回顧性研究納入了116例新確診的胃腺癌患者，發現CTCs陽性組與CTCs陰性組治療前后差異有統計學意義(12.6個月 vs 31.6個月，P<0.01;12.4個月 vs 24.2個月，P=0.002)。兩個化療療程后，病情進展組CTCs數量明顯增加(P=0.002)，而非病情進展組CTCs數量減少(P=0.02)。因此，CTCs的變化與治療反應密切相關(P=0.004)，可作為評估化療效果的輔助手段，引導后續方案的早期調整[26]。

4.預測胃癌預后：液體活檢在預測胃癌患者不良預后方面具有重要作用。一項前瞻性研究通過檢測分子殘留疾病(MRD)，發現所有在術后立即檢測到ctDNA的患者最終都經歷了復發且術后縱向隨訪中任何時間的ctDNA陽性均與較差的術后無病期和總生存期相關。在以治療為目的的局部胃癌患者中，這些結果表明，ctDNA檢測的MRD可以識別患者的復發高風險，并有助于在輔助治療環境中加強治療以提高生存率[27]。近期一項研究采用ddPCR定量68例胃癌和食管癌患者血漿中的miRNA表達，結果發現miR-21-5p、miR-148a-3p、miR-146a-5p、miR-141-3p和miR-218-5p在接受一線治療藥物順鉑和吉西他濱的晚期胃癌患者中沒有預后和(或)預測價值，但高水平的miR-200c-3p顯示出OS惡化的趨勢，提示循環miRNAs可能對改善患者姑息治療選擇有預后和預測價值[28]。Zhao等[29]研究發現，與正常對照組比較，GC組的外泌體HOTTIP表達水平通常上調，其表達水平與侵襲深度、TNM分期顯著相關。另外，外泌體HOTTIP水平升高與總生存期較差顯著相關(P<0.001)，使外泌體HOTTIP成為胃癌患者的獨立預后因素(P=0.027)。

綜上所述，液體活檢作為組織活檢的一種替代方法，是一種微創、廉價、可重復的技術，可以促進胃癌的篩查和早期診斷，為胃癌患者的臨床分期提供更多信息。此外，基于血液的液體活檢有助于監測胃癌的疾病進展、治療療效、預后和獲得性化療耐藥。在未來，醫生可以通過液體活檢，根據實時的基因信息，以個性化醫療的方式為患者選擇最合適的治療方案。然而，液體活檢在臨床廣泛應用前仍有一些實際問題需要解決。潛在的挑戰可能包括樣本中生物學標志物數量少、缺乏分析共識、臨床驗證和監管機構認可等。在此背景下，進行大量的前瞻性臨床試驗是至關重要的。然而，液體活檢從實驗室轉移到床邊需要更大規模和多中心的試驗來證實它的優勢。此外，液體活檢的方法很難統一，每種方法都有其特定的檢測限制、敏感度和特異性。不同液體活檢平臺的結果很難進行比較，在應用于常規診斷之前，需要進行室間質量評價(external quality asseeement,EQA)研究。目前液體活檢在臨床中應用有限，但隨著基因檢測技術的發展和新型生物學標志物的出現，液體活檢將擁有更廣闊的應用前景。