年輕女性行新鮮或凍融單囊胚移植妊娠結局比較

吳燕虹 吳升浩 盧曉聲 付養華 趙軍招

20多年前，多項研究發現，人類胚胎已經可以在體外環境下培養至囊胚期，植入后成功獲得了臨床妊娠[1,2]。近年來，隨著體外培養條件的不斷完善，囊胚形成率越來越高。相對于卵裂期胚胎移植，囊胚培養則是一個優勝劣汰的過程，在生理學上與子宮內膜的發育保持更高的同步性，能夠提高胚胎種植率及臨床妊娠率[3]。隨著囊胚移植在輔助生殖中的應用逐漸增多，在獲得高妊娠率的同時，也伴隨著較高的多胎率，如何在獲得滿意妊娠結局的同時降低多胎率已成為近年來生殖醫學工作者研究的重要方向，有研究表明，單囊胚移植可獲得與雙卵裂期胚胎組同樣滿意的妊娠結局，因此，單囊胚移植應該是個理想的選擇[4]。目前關于新鮮胚胎和凍融胚胎移植后兩者結局差異的文章較多，但針對單囊胚移植在新鮮周期與凍融周期中妊娠結局的差異相關報道則較少。鑒于此，本研究通過比較年輕患者行新鮮或凍融單囊胚移植的妊娠結局，旨在為單囊胚移植進一步提供臨床策略。

對象與方法

1.研究對象:回顧性分析2018年1～12月在溫州醫科大學附屬第二醫院生殖中心采用新鮮周期或凍融周期單囊胚移植的901例患者臨床資料。本研究的入選標準為：移植周期數均為第1次；年齡≤35歲；基礎內分泌水平正常；身體健康，無酗酒、吸毒等不良嗜好；超聲提示雙卵巢、子宮正常，排除不適合本周期移植者。本研究將入選患者根據移植周期不同分為兩組，新鮮單囊胚移植周期組(A組)693例，凍融單囊胚移植周期組(B組)208例。將兩組中滿足臨床妊娠條件(排除晚期流產者，包括早產和足月分娩)的患者根據是否發生早期流產分為早期流產組69例和活產組483例。

2.研究方法

(1)新鮮周期：促排卵方案采用卵泡期超長方案或微刺激方案。當有2～3個卵泡直徑≥18mm，于當晚9～10時肌內注射絨毛膜促性腺激素(hCG)4000～10000IU扳機。扳機后36～38h，在陰道超聲引導下經陰道取卵。獲取的卵母細胞常規行IVF/ICSI受精操作及胚胎培養。采用Gardner囊胚分級法進行分級[5]：以數字1～6對囊胚的擴張度和孵化狀態進行評分，以字母A、B、C對內細胞團(inner cell mass，ICM) 和滋養外胚層細胞(trophectoderm，TE) 進行評分。優質囊胚的標準定義為3期及3期以上、ICM及TE細胞均為B級及以上者；可利用胚胎定義為3期以上、ICM和TE評分不同時為C者。取卵后第5天選取1枚優質囊胚進行移植，如本周期內無優質囊胚者，則選取1枚可利用囊胚進行移植。移植后黃體支持方案為：自取卵日起，地屈孕酮片(商品名：達芙通，劑量：10毫克/片)，每次20mg，每日2次口服；黃體酮軟膠囊(商品名：安琪坦，劑量0.1克/片)，每次0.2g，每日2次口服或陰道給藥。

(2)囊胚玻璃化冷凍及解凍：促排卵方案采用不適合新鮮胚胎移植的方案，如黃體期促排卵方案或高孕酮狀態下促排卵方案等，或者行卵泡期超長方案或微刺激方案促排卵后，因預防卵巢過度刺激綜合征等取消新鮮周期移植。扳機、取卵及囊胚分級同新鮮周期組。胚胎玻璃化凍融采用日本KITAZATO公司的冷凍液和解凍液試劑盒，并按試劑盒說明書中的方法進行操作。

(3)凍融周期：采用激素替代周期或者長效促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a)降調節聯合激素替代方案準備內膜。激素替代周期指在月經周期第2～5天起口服雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片(商品名稱：芬嗎通)中的雌二醇片早晚各1片(含雌二醇2毫克/片)，每隔3～5天予B超監測內膜厚度，根據內膜厚度調整雌二醇片的用量。當子宮內膜厚度≥8mm且孕酮水平<1.5ng/ml時，加用孕激素轉化內膜，即口服地屈孕酮片(商品名：達芙通，劑量：10毫克/片)早晚各1片、雌二醇片/雌二醇地屈孕酮片(商品名稱：芬嗎通)中的雌二醇地屈孕酮片早晚各1片(含雌二醇2毫克/片，地屈孕酮片10毫克/片)以及黃體酮膠囊(商品名：安琪坦，劑量0.1克/片)，早晚各2片口服或陰道給藥。GnRH-a降調節聯合激素替代周期指在卵泡早期或黃體中期全量肌肉注射注射用曲普瑞林(商品名稱：達必佳，3.75毫克/支)進行垂體降調節。注射后的4周則采用激素替代遞方案準備子宮內膜。兩種方案均于轉化日后5天移植1枚優質囊胚，如本周期內無優質囊胚，則選取1枚可利用囊胚進行移植。移植后黃體支持方案同轉化日后用藥。

(4)隨訪：胚胎移植后2周，測血清hCG水平以確定是否妊娠。胚胎移植后4周，陰道超聲檢查發現宮內有孕囊者為臨床妊娠；血hCG≥15mlU/ml或者尿妊娠試驗陽性，但超聲檢查未見孕囊者為生化妊娠；發生在妊娠12周前的流產為早期流產，而發生在12周或之后者為晚期流產。妊娠滿28周至不足37周間分娩者為早產。出生體重<2500g的嬰兒,稱為低出生體重兒，出生體重≥4000g的嬰兒,稱為巨大兒。

結 果

1.兩組患者基本情況及實驗室結局比較:B組的獲卵數明顯多于A組，差異有統計學意義(P<0.05),詳見表1。

表1 兩組患者基本情況及實驗室結局比較

2.兩組患者妊娠結局比較:B組的早期流產率明顯高于A組，差異有統計學意義(P<0.05),詳見表2。

表2 兩組患者妊娠結局比較

3.早期流產組和活產組單因素比較：兩組在配偶年齡、高血壓、糖尿病等慢性疾病史、凍融胚胎移植、既往流產次數、早期自然流產史等方面比較，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 兩組早期流產因素比較[n(%)]

續表3

續表3

4.早期流產危險因素的多因素Logistic回歸:以是否發生早期流產作為因變量，將單因素分析中有意義的變量進一步行多因素Logistic回歸分析，得出配偶年齡、凍融胚胎移植是早期流產發生的獨立危險因素(P<0.05)，詳見表4。

表4 早期流產危險因素的Logistic回歸分析

討 論

新鮮胚胎移植及凍融胚胎移植是目前體外胚胎移植的兩種方式，分別受到不同因素的影響。在新鮮胚胎移植周期，COH過程影響機體激素分泌，高雌激素微環境可能導致子宮內膜成熟度提前、影響子宮內膜容受性、影響胎盤形成及血供等，從而導致不良的圍產期及新生兒結局[6，7]。而凍融胚胎移植周期雖然可避免大量促性腺激素的刺激，提供的宮腔環境更適合生理狀態，但胚胎冷凍可能導致胚胎卵裂球損傷，對母嬰結局的影響仍存爭議[8]。

Ishihara等[9]研究發現，與新鮮單囊胚移植比較，凍融單囊胚移植可獲得與其相似的妊娠結局，且不增加流產率的發生。而Wei等[10]則認為凍融單囊胚移植的種植率、單胎活產率、總活產率及生化妊娠率顯著高于新鮮單囊胚移植，差異有統計學意義(P<0.05)，而流產率前者則低于后者，但差異無統計學意義(P>0.05)。本研究中入選患者的年齡不超過35歲，基礎內分泌水平功能正常者，均為首次取卵及移植，可有效避免高齡、卵巢功能減退以及反復種植失敗的患者可能對研究結果造成的不利影響。研究結果顯示，新鮮單囊胚移植組與凍融單囊胚移植組同樣能獲得滿意的妊娠結局，且兩組在生化妊娠及晚期流產等不良妊娠情況比較，差異無統計學意義。但需要注意的是，凍融單囊胚移植組早期流產率明顯高于新鮮單囊胚移植組，差異有統計學意義(P<0.05)。

本研究對早期自然流產進行的單因素分析結果顯示，包括凍融胚胎移植在內的5個方面比較，差異有統計學意義(P<0.05)，進一步將其進行多因素Logistic回歸分析，提示凍融周期移植是早期流產的獨立危險因素。究其原因，可能是早期流產一般與胚胎質量相關，凍融胚胎經過冷凍、解凍過程可不同程度降低胚胎自身活性。有研究發現，玻璃化冷凍組胚胎染色體異常的發生率顯著高于新鮮胚胎移植組[11]。Ma等[12]研究發現，凍融胚胎移植并非能夠逆轉新鮮胚胎移植對胚胎基因甲基化造成的影響，而是會對胚胎造成新的甲基化紊亂。Hiura等[13]對凍融胚胎移植、新鮮胚胎移植及自然妊娠后獲得足月單胎分娩的人胎盤進行了微陣列基因芯片分析，同樣得出低溫冷凍會對胚胎的表觀遺傳產生影響。研究提示，雖然胚胎冷凍技術也在不斷進步和改善，但胚胎冷凍無疑增加了對胚胎的人為干預，容易對胚胎造成不良影響，從而可能導致早期流產。此外，凍融移植周期子宮內膜準備方案可能與早期流產相關，有研究顯示似乎激素替代周期方案更易導致流產，原因在于該方案相較于自然周期，E2水平更高，而血清高水平的E2通過調節子宮內膜基因的表達影響子宮內膜的容受性進而影響妊娠結局[14]。因此，未來仍需更多的研究來評估胚胎冷凍技術及子宮內膜準備方案對胚胎基因表達調控、子代健康的近、遠期安全性的影響，使研究能夠更好地使用胚胎冷凍保存技術為人類的健康服務。

有報道顯示，凍融移植周期新生兒畸形率更高[15]。但也有研究發現凍融胚胎移植未明顯增加單胎子代畸形的風險[16]。本研究中暫未發現兩組在新生兒畸形率及病死率方面比較，差異有統計學意義。對于新生兒子代體重的影響，一項Meta分析同樣顯示凍融胚胎移植巨大兒、大于胎齡兒發生率高于新鮮胚胎移植組，而早產、低體重兒、小于胎齡兒發生率則低于后者[17]。凍融胚胎移植子代與新鮮胚胎移植子代體重比較，差異有統計學意義，有研究認為這可能與凍融胚胎的表觀遺傳學改變及新鮮胚胎移植時母體高激素血癥有關[18]。但在本研究中，新鮮單囊胚移植組與凍融單囊胚移植組出生新生兒在出生體重、新生兒性別比、巨大兒、低體重兒發生率等方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。可能是因為在促排卵周期，對于卵巢高反應者或具有OHSS高危因素的患者，本中心的做法是盡可能建議其放棄新鮮胚胎移植，考慮行全胚冷凍，從而進一步減少新鮮胚胎移植中母體高激素血癥對產科結局的影響。另外，單囊胚移植也大大減少了多胎妊娠的發生，從而進一步減少了早產兒、低出生體重兒等不良產科結局的發生。這些推斷為解釋凍融單囊胚移植與新鮮單囊胚移植子代未發現差異有統計學意義提供了新思路，但仍需進一步深入研究。

2018年，中華醫學會生殖醫學分會關于胚胎移植數目的中國專家共識已提出建議選擇性單胚胎移植，鑒于良好的囊胚培養技術，中國推行單囊胚移植的時機已成熟。在年輕患者(≤35歲)中，與新鮮單囊胚移植比較，凍融單囊胚移植可以獲得同樣滿意的妊娠結局，且未增加新生兒不良出生結局的風險。對于獲卵數較多、卵巢高反應、具有OHSS高危因素或輸卵管因素性不孕、既往有宮外孕史等異位妊娠高風險人群而言，行凍融單囊胚移植可作為一種優先考慮的臨床移植策略，值得臨床推廣，但需要警惕的是，凍融胚胎移植使早期流產發生風險增加，需要進一步尋找原因和對策解決。