不同脂肪來源嬰兒配方乳粉與母乳脂質組成的差異分析

林 爽，李曉東,*，劉 璐，張秀秀，李春梅，冷友斌，蔣士龍

（1.東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；3.黑龍江飛鶴乳業有限公司，黑龍江 哈爾濱 150030）

母乳是新生嬰兒最好的能量及營養來源，其中乳脂肪可為0～6 個月嬰兒提供所需能量的一半，且為許多必需營養物質的來源，例如：必需脂肪酸、脂溶性維生素和一些生物活性物質等[1]。乳脂肪是由甘油三酯（98%～99%）、磷脂（0.26%～0.80%）以及其他低豐度脂組成。甘油三酯以甘油為骨架，在3 個位置分別酯化3 個脂肪酸，研究顯示脂肪酸的種類及位置分布不僅影響乳脂的理化性質，也會影響脂肪的利用率和嬰兒的舒適度[2-5]。目前在人乳中發現超過400 種甘油三酯及200 種脂肪酸，并且已經證實脂肪酸的分布并不是隨機的，大多數飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）酯化在甘油的sn-2位，且母乳甘油三酯約70%的sn-2位被棕櫚酸（C16:0）占據[6-8]。

但由于母親身體狀況、環境因素等限制，無法實現所有嬰兒的純母乳喂養，因此符合嬰兒成長階段的嬰兒配方乳粉成了第2選擇。為了更好滿足嬰兒的營養需求，要求嬰兒配方乳粉盡量實現脂質組成及結構上的母乳化，目前脂質母乳化主要集中在脂肪酸組成方面，市面上的嬰兒配方乳粉多采用油脂復配的方式模擬母乳脂肪酸組成，植物油和牛乳脂是最常見的脂肪來源[9]。此外，還添加一定量的海藻油、魚油用來補充二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）等長鏈多不飽和脂肪酸（longchain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs）。這使嬰兒配方乳粉在脂肪酸的組成方面接近母乳，但仍存在脂肪消化吸收的差異[10]。

現階段嬰兒配方乳粉對母乳脂肪結構的模擬主要體現在1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1,3-dioleic acid-2-palmitic acid triglyceride，OPO）的應用上，已有很多研究學者表明OPO可以在一定程度上緩解脂肪的消化率和鈣吸收較低的問題[2]。但對于母乳中其他含量豐富的甘油三酯研究尚不透徹，對于不同脂肪來源嬰兒配方乳粉中脂質的存在形式與母乳的差異也不明確。因此，本研究選取4 種市售的不同脂肪來源的嬰兒配方乳粉，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography triple time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Triple-TOF-MS/MS）、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用法對其甘油三酯、總脂肪酸及sn-2位脂肪酸的組成與母乳進行比較研究，分析它們的差異及其可能對脂肪消化產生的潛在影響。旨在為嬰兒配方乳粉的設計與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳是由來自哈爾濱的哺乳期志愿者提供的成熟母乳（大于產后21 d，n=6），年齡18～30 歲，分娩足月兒，母乳充足，孕期或哺乳期間無乳腺炎、感染性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、精神系統疾病、癌癥及其他惡性消耗性疾病，最近2 周沒有使用過藥物及催乳用西藥。采樣時間為上午9—11時之間，在志愿者母親一側乳房喂哺嬰兒時，用電動人乳采集泵同時采集另外一側乳房的乳汁，記錄母乳的采集時間、乳樣質量。母乳采集后保存在10 mL凍存管中，編號后迅速降溫至－4 ℃，冷藏狀態下運送至實驗室，轉移至－80 ℃冰箱避光保存。

嬰兒配方乳粉選取市售的4 種具有不同脂肪來源的0～6 個月嬰兒配方乳粉，包括植物油基嬰兒配方乳粉2 種（IF1、IF2）以及牛乳/植物油混合基嬰兒配方乳粉2 種（IF3、IF4），具體如表1所示。

37 種脂肪酸甲酯標準品、CNWBOND NH2氨基SPE小柱 上海安譜實驗科技股份有限公司；氯仿、甲醇、正己烷、乙腈（均為色譜純），胰脂酶、牛膽鹽 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AB Sciex TripleTOF? 5600＋ Triple-TOF-MS/MS儀美國AB SCIEX公司；LC-30A UPLC儀 日本島津公司；7000D GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；Heraeus Fresco17冷凍微量離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；超聲儀 深圳雷德邦電子有限公司；UGC-24M氮吹儀 北京優晟聯合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取

參考Cheong等[11]的Folch法并加以調整，取凍結母乳于37 ℃水浴融化，并將不同脂肪來源的嬰兒配方乳粉（IF1～4）用超純水分別配制成脂肪質量濃度4.2 g/100 mL的乳液，取5 mL母乳/乳液于50 mL離心管中，加入20 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）和5 mL 0.73% NaCl溶液，混勻后超聲提取10 min，室溫、5 000 r/min離心10 min，收集下層有機相，在氮氣下吹干，制得的脂肪在－20 ℃條件下貯存。

1.3.2 脂肪酸檢測

采用酸催化法對乳脂進行甲酯化處理[12]，取30 mg脂肪，加2 mL硫酸-甲醇（1%），60 ℃水浴30 min（每5 min振蕩1 次），加入1 mL正己烷并用4 mL純水洗滌，取上層有機相，加適量無水硫酸鈉，離心后用正己烷稀釋并加適量的水楊酸甲酯，過0.22 μm有機濾膜后進GC-MS分析。

色譜條件：DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升溫至220 ℃，并維持20 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL/min。進樣量10 μL，分流比30∶1。

質譜條件：電子電離源；進樣口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃，選擇性離子檢測掃描方式；電子能量70 eV。

1.3.3sn-2位脂肪酸檢測

參考高潤穎[13]的方法，用胰脂酶水解甘油三酯獲得sn-2單甘酯。取100 mg脂肪，加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.5 mL膽酸鹽（0.05%）、0.2 mL CaCl2（2.2%）及50 mg豬胰脂酶，振蕩混勻，于37 ℃水浴9 min（每3 min振蕩30 s），加入1 mL HCl（6 mol/L）溶液終止反應，加2 mL無水乙醚渦旋30 s，離心后取有機相吹干。

參考李興峰等[14]的固相萃取方法分離sn-2單甘酯，取水解產物溶于二氯甲烷，制成質量濃度為4 mg/mL溶液，將2 mL脂肪-二氯甲烷溶液移入活化好的氨基SPE小柱中，用8 mL正己烷-乙酸乙酯（85∶15，V/V）溶液分4 次洗脫小柱，棄去淋洗液。然后用6 mL二氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）分3 次洗出sn-2單甘酯，收集洗脫液用氮氣吹干，甲酯化后上樣分析。

1.3.4 甘油三酯檢測

稱取一定質量脂肪，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液復溶，制成1 mg/mL的溶液，過0.22 nm有機相濾膜后進UPLC-Triple-TOF-MS/MS檢測分析。

色譜條件：Phenomen Kinetex C18100A色譜柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為水-甲醇-乙腈（1∶1∶1，V/V）（含10 mmol/L乙酸銨）；流動相B為異丙醇-乙腈（1∶1，V/V）（含10 mmol/L乙酸銨）。梯度洗脫：0～1.0 min，80% A、20% B；1.0～6.0 min，80%～20% A、20%～80% B；6.0～10.0 min，20%～5% A、80%～95% B；10.0～12.0 min，5% A、95% B；12.0～20.0 min，5%～80% A、95%～20% B。流速300 μL/min，柱溫35 ℃，進樣量2 μL。

質譜條件：在控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于信息關聯采集功能進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，采集強度最強且大于100的分子離子對應的二級質譜數據。轟擊能量35 eV，每50 ms采集15 張二級譜圖。電噴霧離子源參數設置如下：霧化氣壓60 Pa；輔助氣壓60 Pa；氣簾氣壓30 Pa，溫度550 ℃；噴霧電壓5 500 V。

1.4 數據處理

利用Qualitative Navigator B.08.00對GC-MS數據進行提取；利用PeakView 2.2軟件分析甘油三酯組成；使用Excel對提取的數據進行預處理，使用SPSS 23.0和Simca 14.1軟件對數據進行差異分析和多變量統計分析。所有實驗均進行6 次平行測定，結果以表示。

2 結果與分析

2.1 嬰兒配方乳粉與母乳的脂肪酸組成分析

2.1.1 嬰兒配方乳粉與母乳總脂肪酸組成

如表2所示，共檢測出27 種脂肪酸，母乳中含量最高的3 種脂肪酸依次為油酸（C18:1，（36.3±1.24）%）、亞油酸（C18:2，（26.28±0.05）%）和棕櫚酸（C16:0，（19.13±1.03）%），該結果與Chen等[15]的研究結果一致，而4 種不同脂肪來源嬰兒配方乳粉中含量最高的脂肪酸分別為油酸（34.42%～41.32%）、棕櫚酸（21.80%～27.16%）、亞油酸（15.69%～19.19%），且4 種嬰兒配方乳粉中亞油酸的含量都顯著低于母乳（P＜0.05）。

表2 不同脂肪來源的嬰兒配方乳粉與母乳的總脂肪酸組成Table 2 Total fatty acid composition of infant formula with different fat sources and human milk

就SFAs含量而言，4 種嬰兒配方乳粉都顯著高于母乳（P＜0.05），同時沒有在植物油基IF1、IF2中檢測到短鏈脂肪酸，而牛乳/植物油混合基IF3和IF4中短鏈脂肪酸的含量顯著高于母乳（P＜0.05），這是由于天然植物油中幾乎不含有短鏈脂肪酸，而牛羊等反芻動物由于瘤胃中微生物的發酵作用，使乳脂中含有更多的短鏈脂肪酸[16-17]，人乳中的短鏈脂肪酸具有調節嬰兒脂質代謝，降低肥胖風險，保護和促進腸道成熟等作用[18]。對于MC-SFAs，IF1和IF2的含量明顯高于IF3、IF4和母乳（P＜0.05），尤其是辛酸（C8:0，0.75%～1.00%）和月桂酸（C12:0，5.55%～8.11%），這可能是由于IF1和IF2添加了較多富含中鏈脂肪酸的椰子油。與長鏈飽和脂肪相比，中鏈脂肪酸對膽汁鹽的依賴性小，可通過胃腸黏膜直接吸收，因此可以快速供能，更符合早產兒及患有吸收不良嬰兒的能量需求[19-20]。此外，中鏈脂肪酸也具有抗菌和抗病毒的特性[21]，在保護嬰兒免受有害微生物侵害的同時，對嬰兒早期腸道菌群的建立也有一定的影響[22-23]。但如果中鏈脂肪酸食用濃度過高，會阻止嬰兒對其他必需脂肪酸的利用，并產生對某些器官有潛在毒性的代謝物[24]，因此嬰兒配方乳粉在脂肪調配過程中要注意濃度。4 種嬰兒配方乳粉LC-SFAs的含量與母乳差異不大，且都含有較高的棕櫚酸，IF3和IF4尤為明顯，這也從側面驗證了牛乳中棕櫚酸的高含量[25]。

就MUFAs而言，4 種嬰兒配方乳粉與母乳差異不大，都具有高含量的油酸。對于PUFAs的含量，母乳顯著高于4 種嬰兒配方乳粉（P＜0.05），本質原因在于母乳中含有更多的亞油酸，這也表明嬰兒配方乳粉應該適量上調亞油酸的添加量。值得注意的是IF2和IF3中沒有檢測到亞麻酸（C18:3），而亞麻酸作為一種必需脂肪酸是合成DHA等ω-6 LC-PUFAs的前體[26]，對嬰兒大腦和視力都具有重要作用，且亞油酸和亞麻酸的比例還會影響LCPUFAs的內源性合成，GB 10765—2010《準嬰兒配方食品》中規定嬰兒配方乳粉中亞油酸/亞麻酸的比值范圍為5∶1～15∶1，可根據此比例確定嬰兒配方乳粉中亞油酸和亞麻酸的添加情況。此外，可以看出4 種嬰兒配方乳粉都有補充ARA、DHA等LC-PUFAs，說明LC-PUFAs對嬰兒的功能特性已經廣泛被大家所接受和認可。

總體看來，目前嬰兒配方乳粉可以較好的模擬母乳脂肪酸的大體組成，滿足嬰兒基礎的能量需求。但除了脂肪酸組成之外，其位置分布也對脂質的消化吸收有重要的影響。

2.1.2 嬰兒配方乳粉與母乳sn-2位脂肪酸組成

由于胃腸脂肪酶具有位置選擇性，特異性水解甘油三酯的sn-1,3位，生成sn-2單甘酯和游離脂肪酸，如果游離脂肪酸中含有過多的LC-SFAs，就容易與嬰兒胃腸中的鈣鎂離子結合，生成不溶性的“鈣皂”，從而在降低脂肪和鈣吸收率的同時增加嬰兒的糞便硬度，降低嬰兒胃腸舒適度。而sn-2單甘酯以特殊的機制重新形成甘油三酯后被利用，因此LC-SFAs分布在甘油三酯的sn-2上，就可以減少“鈣皂”的產生，提高脂肪和鈣的利用率及嬰兒的舒適度，有利于嬰兒的生長發育[27]。母乳脂肪具有特殊的脂肪酸分布，如表3所示，接近70%的SFAs酯化在母乳甘油酯的sn-2位上，這有利于嬰兒對脂肪和鈣的吸收，其中含量最高是棕櫚酸，母乳中一半以上的棕櫚酸（（51.69±0.97）%）酯化在sn-2位上。相比之下，4 種嬰兒配方乳粉sn-2位SFAs的含量顯著低于人乳（P＜0.05），與IF1（（19.18±1.58）%）和IF2（（22.12±2.02）%）相比，添加了OPO結構脂的IF3（（54.81±1.62）%）和IF4（（54.08±1.48）%）與母乳間sn-2位SFAs及sn-2位棕櫚酸的含量差距明顯更小，但仍然沒有達到母乳水平。

表3 不同脂肪來源的嬰兒配方乳粉與母乳的sn-2位脂肪酸組成Table 3 sn-2 Fatty acid composition of infant formula with different fat sources and human milk

4 種嬰兒配方乳粉中sn-2位MUFAs和PUFAs的含量都明顯高于人乳（P＜0.05），尤其是未添加OPO結構脂的IF1（（80.83±2.62）%）和IF2（（77.88±1.84）%），其中占比最高的為油酸（52.70%～52.95%）和亞油酸（22.92%～26.30%）。總脂肪酸中IF1、IF2油酸的含量接近母乳，亞油酸的含量低于母乳，而在sn-2位脂肪酸中IF1和IF2油酸與亞油酸的含量都顯著高于母乳（P＜0.05），說明它們與母乳的脂肪酸位置分布存在很大差異。此外植物油基IF1和IF2含有更高比例的sn-2位中鏈脂肪酸，尤其是月桂酸，而IF3、IF4和母乳含有較高比例的長鏈脂肪酸，這也說明不同脂質來源不僅對嬰兒配方乳粉脂肪酸組成有一定影響，也會影響脂肪酸的位置分布。相比之下，以牛乳脂為部分脂肪原料的嬰兒配方乳粉（IF3、IF4）在脂肪酸位置分布上明顯更加接近母乳。同時由表3可以看出，很多母乳中的sn-2位脂肪酸（C11:0、C13:0、C20:0、C23:0、C20:5等）并沒有在4 種嬰兒配方乳粉中被檢測到，這也側面反映了母乳脂質組成的復雜性。

2.2 嬰兒配方乳粉與母乳的甘油三酯組成測定結果

2.2.1 嬰兒配方乳粉與母乳的甘油三酯組成分析

由于本研究采用的UPLC-Triple-TOF-MS/MS不能分離同分異構體，所以表4中甘油三酯上的脂肪酸為隨機排列，不顯示位置特異性。由表4可知，共檢測出87 種甘油三酯，母乳中含量最豐富的為OPL（（15.37±1.40）%）和OPO（（14.56±1.40）%），這與之前的研究結果一致[28-30]，與西方母乳中OPO含量最高不同的是，中國母乳中含有更多的OPL，這可能與西方普遍食用橄欖油，而中國普遍食用富含亞油酸的大豆油有關，也進一步驗證了飲食習慣對母乳脂肪組成的影響。其他含量較高的依次為LPL（（8.91±0.91）%）、POS（（5.59±0.84）%）和OOL（（4.89±0.75）%）等富含不飽和脂肪酸的甘油三酯，這更加適合嬰兒對脂肪的消化吸收。母乳中接近23%的甘油三酯為中長鏈甘油三酯，其兼具中鏈甘油三酯和長鏈甘油三酯的優點，可以平穩的釋放脂肪酸，并避免有毒代謝物的產生，且中長鏈甘油三酯水解產生的單甘酯也被證明具有很強的抑菌、抗病毒的活性[31-32]。

表4 不同脂肪來源的嬰兒配方乳粉與母乳的甘油三酯組成Table 4 Triglyceride composition of infant formula with different fat sources and human milk

續表4

4 種不同脂質來源的嬰兒配方乳粉都含有較高的OOO（4.58%～8.22%）、LLL（5.08%～7.98%）、OLL（5.47%～8.56%）和PPO（3.78%～8.70%），明顯高于它們在母乳中的含量（分別為（3.43±0.32）%、（2.60±1.14）%、（3.37±1.19）% 和（2.47±0.46）%）（P＜0.05），這些甘油三酯主要由油酸和亞油酸組成，說明嬰兒配方乳粉中油酸和亞油酸的存在形式與母乳有很大的不同，由sn-2位脂肪酸組成分析可知，在嬰兒配方乳粉中，尤其是植物油基的IF1和IF2中，油酸和亞油酸更多的占據在甘油三酯的sn-2位，而它們在母乳中大多數分布在sn-1,3位。由于牛乳/植物油混合基IF3和IF4補充了一定量的OPO結構脂，因此在OPO含量上，相比于IF1（（4.99±1.33）%）和IF2（（4.13±0.48）%），IF3（（9.58±1.11）%）和IF4（（7.53±0.39）%）更接近母乳，但仍存在著較大的差距。同時，在OPL和LPL含量方面，4 種嬰兒配方乳粉都遠沒有達到母乳的水平，由Chen等[33]的研究結果及sn-2位脂肪酸組成分析可知，OPL、LPL同OPO一樣富含sn-2棕櫚酸，可以降低嬰兒糞便硬度，促進脂肪和鈣的吸收，因此未來嬰兒配方乳粉在進一步提高OPO含量的同時，也應注意對母乳OPL、LPL的模擬。另外，從表4可以看出，4 種嬰兒配方乳粉都含有較高的中鏈甘油三酯，例如：CaLaM、CyLaLa、CaMM等，尤其是IF1和IF2，總含量高達20%，明顯高于母乳（（2.18±0.33）%）（P＜0.05），但在中長鏈甘油三酯含量上，卻明顯低于母乳（P＜0.05），這對嬰兒日后的成長是否會產生影響目前尚不清楚，需要進一步的探究。另外，母乳含有較多富含超LC-PUFAs（如C20:4、C22:6）的甘油三酯，而嬰兒配方乳粉中含有較多富含超LC-SFAs（如C20:0、C22:0）的甘油三酯，這種特性在額外添加乳油的IF4中尤為明顯。

2.2.2 嬰兒配方乳粉與母乳甘油三酯組成的差異分析

為進一步明確不同脂質來源的嬰兒配方乳粉與母乳在甘油三酯組成上的差異，對表4中不同乳樣甘油三酯的組成進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），表征不同脂質來源嬰兒配方乳粉與母乳甘油三酯的組成差異。并篩選變異權重參數值（variable importance in projection，VIP）大于1且P值小于0.05的甘油三酯作為不同樣品的差異脂質。

如圖1所示，所有樣本點表現出明顯的聚類趨勢，未發現離群樣本點，說明建立的OPLS-DA模型對30 個樣品進行有效分類，同時模型的Q2=0.961，說明建立的OPLS-DA模型穩定性較好。

圖1 不同脂質來源嬰兒配方乳粉及母乳甘油三酯組成的OPLS-DA圖Fig.1 OPLS-DA model score chart of triglycerides in infant formula with different lipid sources and human milk

由圖1可知，母乳與4 種嬰兒配方乳粉形成了明顯區分，表明不同脂質來源的嬰兒配方乳粉在甘油三酯組成上均與母乳存在較大差異。其中植物油基的IF1和IF2較為接近，牛乳/植物油混合基的IF3和IF4較為接近，這說明不同脂質來源對嬰兒配方乳粉的甘油三酯組成影響十分明顯。將不同脂質來源嬰兒配方乳粉與母乳的差異甘油三酯列于表5，共16 種。

表5 不同脂質來源嬰兒配方乳粉與母乳差異脂質種類Table 5 Differential triglycerides between infant formula with different lipid sources and human milk

為了更具體了解差異甘油三酯在嬰兒配方奶粉和母乳中含量差異，通過繪制熱圖和層次聚類分析，對其分布進行表征，結果如圖2所示。圖顏色由藍色到紅色，代表含量由低到高。

圖2 差異甘油三酯在不同脂質來源嬰兒配方乳粉及母乳中的分布Fig.2 Distribution of differential triglycerides in infant formula with different lipid sources versus human milk

圖2進一步表明了不同脂質來源嬰兒配方乳粉與母乳甘油三酯組成存在顯著差異，與4 種嬰兒配方乳粉相比，母乳中OPL、OPO、LPL及以LaPL為代表的中長鏈甘油三酯明顯更高，同時結合前文母乳sn-2棕櫚酸含量超過50%這一結果，可以對母乳脂質的高消化吸收率進行解釋。IF1和IF2含有較多的OOO、OLL及中鏈甘油三酯，這是植物油基嬰兒配方乳粉的顯著特征。添加了牛乳脂的IF3和IF4中差異甘油三酯的普遍含量介于IF1～IF2和母乳之間，說明乳脂的添加可以略微彌補混合植物油的不足，縮短與母乳脂質組成的差距，但需要注意的是在LaPL、CaML等中長鏈甘油三酯含量上，牛乳/植物油混合基IF3、IF4與母乳的差異仍很大，因此在未來嬰兒配方乳粉的設計上需著重注意中長鏈甘油三酯的模擬。

3 結論

4 種不同脂肪來源的嬰兒配方乳粉與母乳脂質組成均存在較大差異，尤其在sn-2位脂肪酸分布和甘油三酯組成方面。OPO結構脂的應用在一定程度上可以縮短嬰兒配方乳粉與母乳脂質組成的差距，但效果有限，因此還應對母乳中其他高含量的甘油三酯進行模擬，如OPL、LPL、LaPL等。同時脂肪來源的不同會顯著影響嬰兒配方乳粉的脂質組成，與植物油基相比，牛乳/植物油混合基嬰兒配方乳粉在脂質組成上更加接近母乳，可能更適合作為新生嬰兒的能量來源。