基于PCR-CE技術的NFC橙汁與FC橙汁鑒別

孫瑞雪，邢冉冉，張九凱，葛毅強，張葳葳，陳 穎,

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.中國農村技術開發中心，北京 100045；4.中國農業大學理學院，北京 100083）

隨著人們生活水平的提高以及健康意識的增強，純果汁受到消費者的喜愛[1]。純果汁分為復原果汁（from concentrate，FC）和非復原果汁（not from concentrate，NFC）兩大類。GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》[2]中指出，采用機械方法直接制成的可發酵但未發酵，未經濃縮的汁液制品為原榨果汁即非復原果汁；在濃縮果汁中加入其加工過程中除去的等量水分復原而成的為復原果汁。相比FC橙汁，NFC橙汁因其營養健康和純天然的特征，更接近甜橙原果品的品質，消費者喜愛度更高，競爭優勢日益顯現，產業發展也較為迅速。據統計，2017—2018年間，歐盟果汁市場FC果汁銷售量降低了2.6%，NFC果汁銷售量增加了2.1%[3]。根據歐睿國際公布的2019中國果汁報告顯示，2013—2018年間，國內市場NFC果汁的零售量由580萬 升增長至4 600萬 升，市場銷售規模從3億 元增長至25.7億 元[4]。當前，NFC橙汁的價格約為FC橙汁價格的2～3 倍[5]。在經濟利益的驅使下，不法商販利用低價FC橙汁冒充高價NFC橙汁進行銷售，極大地損害了消費者的利益[6]。因此，開展NFC橙汁與FC橙汁的真偽鑒別方法研究，對保護消費者利益，維護果汁市場秩序具有重要意義。

關于NFC果汁與FC果汁的真偽鑒別，近年來開始成為人們的關注熱點，已有利用光譜、電子鼻、穩定同位素質譜、液相色譜-質譜等技術開展的相關研究。如Shen Fei等[7]針對鮮榨橙汁中摻入濃縮橙汁的問題，利用電子鼻和傅里葉變換近紅外光譜技術，結合多元數據分析方法，建立了濃縮橙汁與鮮榨橙汁線性判別分析模型，鑒別準確率分別為91.7%和87.5%。W?odarska等[8]利用同步熒光光譜技術，比較分析了市售NFC蘋果汁和FC蘋果汁的熒光特性，發現非酶褐變產物的熒光信號是區分NFC蘋果汁和FC蘋果汁的關鍵因素，結合偏最小二乘判別分析模型，可區分兩類蘋果汁。此外，近年還有學者利用實時直接分析離子源結合四極桿飛行時間質譜對NFC橙汁和FC橙汁進行了鑒別，偏最小二乘判別分析模型預測集及驗證集準確率分別為97%和95%[6]。上述方法在一定程度上實現了NFC果汁和FC果汁的鑒別，但是容易受到原料產地、生產條件、品種以及果汁加工方式、貯藏條件等因素的影響，且不同品牌、批次、地域橙汁差異較大，對方法的準確性造成影響[9]。與基于代謝產物進行分析的方法相比，基于核酸的分子生物學技術由于其判別產物是遺傳物質，不受到上述因素的影響[10-11]，能夠保證判別結果的準確性，已應用于不同品種果汁的鑒別中。例如，柑橘與甜橙的葉綠體亮氨酸-tRNA合成酶-苯丙氨酸-tRNA合成酶間區基因（tRNA-Leu-tRNAPhe gene，TrnL-TrnF）存在8 bp堿基差異，基于該差異相關學者利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[12]、實時PCR[13-15]等技術為柑橘汁冒充橙汁的問題提供了鑒別方法。然而，由于NFC橙汁屬于一種新型果汁，相關的標準出現較晚，尚需不斷完善。目前采用分子生物學技術鑒別NFC橙汁與FC橙汁的研究鮮有報道，個別文獻僅評價了加熱對橙汁DNA完整性影響[16-17]，但仍未解決如何鑒別FC橙汁冒充NFC橙汁的問題。

由于NFC橙汁與FC橙汁加工工藝不同，NFC橙汁加工條件往往相對溫和，而FC橙汁需經過濃縮、復配、二次殺菌等工藝[18]，導致2 類橙汁的DNA降解程度存在差異。因此本研究按照2 類橙汁的主流生產工藝[19-20]，選取哈姆林、早金、特洛維塔3 種市場上常見適宜加工的甜橙品種[21]，結合自制和市售的NFC橙汁、FC橙汁，通過研究關鍵加工單元操作對甜橙葉綠體成熟酶K蛋白基因（maturase K，matK）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶基因（nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase，ndhF）的DNA降解規律的影響，挖掘NFC橙汁與FC橙汁DNA完整性的差異，建立兩類橙汁的分子生物學定性鑒別方法，以期為果汁行業有序健康發展及有效監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特洛維塔、哈姆林、早金3 種甜橙（Citrus sinensisL.Osbeck）橙果由重慶派森百橙汁有限公司提供，產地為重慶忠縣；15 種市售NFC橙汁（編號NFC1～NFC15）購自北京連鎖超市。

DP320新型植物基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司；高保真Taq酶、高保真Taq酶緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷酸混合液 大連寶生物工程有限公司；無水乙醇 北京六合通公司；5067-1505 DNA 1000試劑盒美國安捷倫公司。

1.2 儀器與設備

Wahlei壓榨機 德國Wahlei公司；WZB阿貝折光儀上海精密分析儀器廠；APV-2000均質機 德國APV公司；STEPHAN UM5破碎機 德國Stephan公司；JYZ-V911多功能原汁機 九陽股份有限公司；R308真空旋轉蒸發儀 美國Senco公司；1083型恒溫振蕩水浴德國GFL公司；UHT殺菌機 上海銳元機械設備有限公司；5920R型冷凍高速離心機 德國艾本德公司；渦旋振蕩器、MS3芯片混勻儀 德國IKA公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR儀 美國應用生物系統公司；2100生物分析儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

自制NFC橙汁：3 種不同品種的甜橙果實采摘后，運抵濟南果品研究院中式車間。選取新鮮無霉變的橙果，流水沖洗橙皮表面污漬，去皮、切半、破碎后進行榨汁，紗布過濾后制得鮮榨橙汁；利用旋轉蒸發儀在室溫下進行脫氣，再于20 MPa壓力下均質得到均質橙汁；最后經巴氏殺菌（80 ℃、10 min）后迅速冷卻灌裝得到NFC橙汁。

自制FC橙汁：將NFC橙汁置于真空旋轉蒸發儀，在60 ℃濃縮至（65±1）°Brix，再加入濃縮過程中去除的等量水分復原，經二次巴氏殺菌（80 ℃、10 min）后冷卻灌裝制得FC橙汁。

關鍵加工單元橙汁：收集榨汁、均質、巴氏殺菌（NFC橙汁）、濃縮、二次巴氏殺菌（FC橙汁）關鍵加工單元橙汁。

1.3.2 橙汁DNA提取及分析

按照天根新型植物基因組提取試劑盒（DP320）說明書提取橙汁樣品DNA。使用NanoDrop核酸蛋白分析儀檢測DNA的濃度，以A260/A280比值判斷DNA純度。

1.3.3 引物設計

基于甜橙葉綠體matK（GenBank No.AB762345.1）和ndhF（GenBank No.NC_008334）基因序列，采用Primer Premier5[22]軟件自行設計了擴增不同長度目標條帶的8對引物。采用植物通用擴增引物plant159F/R（來自RuBPCase基因）用以驗證提取DNA的質量[23]，擴增條帶長度為159 bp。以上引物均由生工生物（上海）股份有限公司合成，具體引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences for PCR amplification

1.3.4 PCR擴增及產物毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）檢測

PCR擴增均采用25 μL反應體系，包括：10×高保真Taq酶緩沖液2.5 μL，三磷酸脫氧核糖核苷酸混合液2 μL，高保真Taq酶0.2 μL，10 μmol/μL上下游引物各0.5 μL，1 ng/μL的DNA模板10 μL，加無菌去離子水至25 μL。matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R、matK4-F/R、ndhF1-F/R、ndhF2-F/R、ndhF3-F/R、ndhF4-F/R引物對的PCR擴增反應程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；最后72 ℃延伸10 min。通用引物plant159F/R的PCR擴增反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40 個循環；最后72 ℃延伸5 min[23]。上述8 組自行設計的引物對分別進行PCR擴增反應后，將matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R、matK4-F/R引物對的PCR產物和ndhF1-F/R、ndhF2-F/R、ndhF3-F/R、ndhF4-F/R引物對的PCR擴增產物分別等量混合。使用生物分析儀對混合PCR擴增產物進行CE分析，流程如下：準備注膠平臺，加入9 μL核酸凝膠染料制備芯片，在芯片樣品孔中各加入5 μL指示條帶混合液，分子質量標準孔中加入1 μL DNA分子質量標準溶液，相應標記的樣品孔中加入4 μL混合PCR擴增產物。利用芯片混勻儀渦旋混勻1 min后上樣分析。

1.4 數據分析

利用SPSS 26.0統計學軟件對DNA濃度和純度進行單因素方差分析，結果表示為，方差分析采用LSD法[24]，P＜0.05，為有效統計學差異。

2 結果與分析

2.1 目標基因的確定和特征差異性片段組合的篩選

獲得高質量DNA是建立NFC橙汁和FC橙汁PCR-CE鑒別方法的基礎。本研究中，鮮榨、均質、巴氏殺菌、濃縮、二次殺菌前后關鍵加工單元橙汁提取的DNAA260/A280值在1.1～1.5之間，質量濃度在4.6～9.17 ng/μL之間（表2）。基于植物通用引物plant159F/R均可擴增出長度為159 bp的目標條帶，表明本研究提取的各關鍵加工工藝中橙汁DNA（表2），適用于后續PCR鑒別方法的研究。

表2 關鍵加工單元中橙汁提取DNA的濃度和純度Table 2 Concentration and purity of DNA extracted from orange juice from key processing units

由于NFC橙汁與FC橙汁加工工藝不同，因此會造成DNA降解程度的不同。研究分析橙汁關鍵加工工藝對DNA降解的影響，闡明NFC橙汁和FC橙汁DNA降解變化情況，能夠為從DNA層面實現二者的區分提供依據和方法。本研究以特洛維塔甜橙為研究對象，選取NFC橙汁和FC橙汁加工過程中的榨汁、均質、巴氏殺菌、真空蒸發濃縮、二次巴氏殺菌作為關鍵加工工藝，采用8 組引物對，對上述關鍵加工工藝處收集的橙汁樣品DNA分別進行不同長度目標條帶的擴增，研究不同加工工藝條件對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響。擴增結果表明，特洛維塔甜橙經榨汁和均質處理得到的橙汁樣品DNA，經8 組引物對PCR擴增后，均能得到目標條帶（圖1），說明榨汁和均質的機械力作用對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響較小。橙汁經巴氏殺菌處理后，DNA發生降解，無法擴增出matK基因中長度為1 515 bp和ndhF基因中長度為1 807、1 044 bp的目標條帶，只能擴增出長度相對短的（972、498、276、512、372 bp）5 條目標條帶。說明巴氏殺菌可造成橙汁matK和ndhF基因的DNA降解。橙汁經濃縮處理后，與巴氏殺菌工藝相比較發現，擴增結果基本一致，說明濃縮處理對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響較小。FC橙汁經二次巴氏殺菌處理后，與巴氏殺菌和濃縮處理比較而言，最大的差別在于長度為972 bp的matK基因目標條帶降解至無法檢出。由此說明，榨汁、均質及濃縮處理對橙汁matK和ndhF基因的DNA降解影響較小，巴氏殺菌對橙汁2 個基因的DNA降解影響較大，二次巴氏殺菌處理對橙汁matK基因的DNA降解影響較大。本研究結果表明加熱會顯著影響目的基因的DNA降解，這與文獻報道一致，Chen Ying等[25]發現豆乳加工過程中的熱處理是導致豆乳DNA降解的關鍵步驟之一，而均質處理未引起目標DNA條帶長度的顯著性變化。此外，該現象在其他食品基質中也有發現，研究表明大豆、玉米焙烤及阿膠加工過程中的熱處理均會造成其DNA明顯程度的降解[26-28]。相比豆乳、玉米等食品基質，橙汁的pH值（3.5～3.8）較低[29]，在加熱狀態下可加速酸催化反應，加劇了DNA的降解程度。

圖1 橙汁加工過程中葉綠體基因matK和ndhF不同片段的PCR-CE擴增結果Fig.1 PCR-CE results obtained for different fragments of chloroplast genes matK and ndhF during orange juice processing

在本研究中，ndhF2-F/R和matK3-F/R引物對分別可擴增長度為1 044 bp和972 bp的目標條帶。經巴氏殺菌后，長度略短且GC含量較高的matK3-F/R引物對擴增的目標條帶仍可檢出，而長度略長且GC含量較低的ndhF3-F/R引物對擴增的目標條帶無法檢出。以往研究結果表明，食品加工過程中，較短DNA片段穩定性大于長的DNA片段[28]。除受目標條帶長度影響外，GC含量也是引起DNA降解的重要因素。當DNA片段長度接近時，經高溫處理后，GC含量高的片段的穩定性要高于GC含量低的片段。Xing Fuguo等[30]的研究發現，在米飯經過蒸煮之后，GC含量為51.4%的Cry1Ab片段（142 bp）的穩定性明顯高于GC含量為50.6%、48.6%的SPS片段（160 bp）和Pubi片段（142 bp）。此外，機械力作用也是引起食品DNA降解的關鍵因素[31]。本研究中橙汁榨汁和均質處理的機械力強度不大，因此未對橙汁DNA降解產生顯著影響[25]。

綜上，由于NFC橙汁與FC橙汁經ndhF1-F/R、ndhF2-F/R、ndhF3-F/R、ndhF4-F/R引物對擴增后，均可擴增出ndhF基因中長度為372 bp和512 bp的目標條帶，擴增結果一致。而NFC橙汁可分別由matK1-F/R、matK2-F/R和matK3-F/R引物對擴增出甜橙葉綠體matK基因中長度為276、498 bp和972 bp的目標條帶，FC橙汁僅可擴增出長度為276 bp和498 bp的目標條帶。因此，本研究選取matK基因為目標基因，將matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的長度為276、498、972 bp目標條帶作為鑒別NFC橙汁與FC橙汁的特征差異性基因片段組。

2.2 貨架期內NFC橙汁與FC橙汁特征差異性片段組穩定性分析

市售NFC橙汁的貨架期一般為28 d。在貯藏過程中，乳酸菌發酵引起的pH值降低以及微生物菌落數量增加引起的核酸酶作用增強，會加快DNA的降解速度[31-33]。因此，為研究matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的目標條帶能否在保質期內的NFC橙汁中穩定存在，本研究將特洛維塔NFC橙汁與FC橙汁置于4 ℃條件下進行市售NFC橙汁貯藏模擬實驗，并分別于0、7、14、21、28 d取橙汁提取DNA后進行PCR擴增。如圖2所示，特洛維塔NFC橙汁4 ℃貯藏0～28 d后，其DNA仍可擴增出長度為276、498 bp和972 bp的目標條帶，FC橙汁的DNA可擴增出長度為276 bp和498 bp的目標條帶。說明在橙汁保質期內，用于區分NFC橙汁和FC橙汁的特征差異性基因片段組可穩定存在，從而避免假陰性結果的產生。

圖2 matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組對貨架期內的特洛維塔NFC橙汁與FC橙汁的PCR-CE擴增結果Fig.2 PCR-CE results obtained for Trovita NFC orange juice and FC orange juice within shelf life with matK1-F/R,matK2-F/R and matK3-F/R

2.3 方法適用性分析

為驗證matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的長度為276、498 bp和972 bp目標條帶組在鑒別NFC橙汁和FC橙汁中的適用性，本研究選取由特洛維塔、早金及哈姆林3 種甜橙自制的NFC橙汁和FC橙汁，提取DNA后進行PCR擴增。擴增結果顯示，陽性對照（鮮榨橙汁）和3 種NFC橙汁均可擴增出長度為276、498 bp和972 bp的目標條帶，3 種FC橙汁僅可擴增出長度為276 bp和498 bp的目標條帶（圖3），說明matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物組擴增的目標條帶組可適用于NFC橙汁和FC橙汁的鑒別。

圖3 matK1-F/R、matK2-F/R、matK3-F/R引物對自制NFC橙汁與FC橙汁PCR-CE擴增結果Fig.3 PCR-CE results obtained for NFC orange juice and FC orange juice manufactured in laboratory with matK1-F/R,matK2-F/R and matK3-F/R primers

2.4 市售NFC橙汁樣品的檢測

采用建立的PCR-CE方法對15 份市售NFC橙汁進行鑒定，結果如表3所示。市售NFC橙汁NFC1～NFC13樣品可擴增出276、498 bp和972 bp的目標條帶，說明該橙汁樣品中檢出可表征NFC橙汁存在的特征差異性基因片段組，進而表明NFC1～NFC13樣品中存在NFC橙汁成分。而市售NFC橙汁NFC14和NFC15樣品僅可擴增出276 bp的目標條帶，說明這2 個橙汁樣品中無法檢出可表征NFC橙汁存在的特征差異性基因片段組，進而表明樣品中不含NFC橙汁成分，存在標簽不符合的現象。

表3 市售NFC橙汁與FC橙汁鑒別結果Table 3 Results of identification of commercial NFC orange juice and FC orange juice

3 結論

以NFC橙汁和FC橙汁為對象，以常規PCR技術為基礎，利用不同加工工藝橙汁中葉綠體matK基因的DNA降解程度的差異，建立一種基于PCR-CE技術的NFC橙汁與FC橙汁定性鑒別方法。并對方法的穩定性和適用性進行分析。此外，基于建立的PCR-CE方法對市售NFC橙汁樣品進行鑒定，結果發現部分市售NFC橙汁存在標簽錯誤的問題。本研究可為FC橙汁、橙汁飲料完全冒充NFC橙汁等摻假問題的評判提供解決方案，為NFC橙汁的品質評價和真偽鑒別提供技術支撐。后續可將新型熱殺菌和非熱殺菌等不同殺菌方式均納入研究范圍，并開展NFC橙汁含量定量檢測研究，以進一步完善NFC橙汁真偽檢測方法，為有效監控NFC橙汁質量提供科學依據。