通塞宣肺合劑對博來霉素誘導的肺纖維化的防治作用研究

張帥　黃思詩　張榮昶　龔小妹

【摘 要】 目的：觀察通塞宣肺合劑對抗博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化的防治作用。方法：18～22 g SPF級昆明種雄性小鼠48只，隨機分為對照組、模型組、陽性組、通塞宣肺合劑高劑量組、通塞宣肺合劑中劑量組、通塞宣肺合劑低劑量組，每組8只。除空白組外，采用對小鼠鼻腔一次性滴注博萊霉素（6 mg/kg）建立肺纖維化動物模型。各組于造模14 d后開始相應的藥物干預，空白組和模型組采用生理鹽水（NS）灌胃，陽性組給予地塞米松（1 mg/kg/d）灌胃，其余各組每天分別給予高、中、低劑量制劑灌胃。實驗開始測定小鼠體重，干預14 d后處死各組小鼠。肺組織勻漿測定羥脯氨酸（HYP）;ELISA法檢測肺組織中白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子（TNF-α）含量;實時熒光定量PCR檢測肺組織TGF-β1mRNA表達水平。HE染色觀察肺組織病理切片，Masson染色觀察膠原纖維的分布情況。結(jié)果：與模型組比較，通塞宣肺合劑小鼠HYP、IL-4、TNF-α的的表達水平顯著性地降低（P<0.01），中、低劑量組也有一定的效果（P<0.05）;IL-10含量表達顯著性的增高（P<0.01），中、低劑量組也有一定的效果（P< 0.05）;HE和Masson染色顯示，通塞宣肺合劑高劑量組肺泡炎損傷和肺纖維化病變程度明顯減輕（P<0.01），效果最好。結(jié)論：通塞宣肺合劑可以通過抑制炎癥因子IL-4、TNF-α促炎癥細胞因子的釋放，提高IL-10的表達，降低HYP的含量發(fā)揮抗肺纖維化的作用，對博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化具有一定的防治作用。

【關(guān)鍵詞】 通塞宣肺合劑;博萊霉素;肺纖維化

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】 A? 【文章編號】1007-8517（2022）07-0032-05

基金項目：國家重點研發(fā)計劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”專項“民族醫(yī)藥傳承研究”項目（2017YFC170 3901）;防城港市科學與技術(shù)開發(fā)項目科技基地與人才專項（防科AC21014042）;防城港市科學與技術(shù)開發(fā)項目（防科字[2016]7號）。

作者簡介：張帥（1989-），男，漢族，碩士研究生，副主任中藥師，研究方向為中藥、京族醫(yī)藥制劑開發(fā)及藥理作用研究。E-mail：yimingsir@163.com

通信作者：黃思詩（1984-），女，漢族，碩士研究生，講師，研究方向為中藥民族藥制劑及藥理作用研究。E-mail：237526977@qq.om

Study on Effect of Tongsai Xuanfei Prescription Mixture to Inhibit Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis in Mice

ZHANG Shuai1 HUANG Sishi^2*ZHANG Rongchang1 GONG Xiaomei3

1.Traditional Chinese Medicine Hospital of Fang Chenggang， Fangchenggang 538021，China;

2.Gungxi Medical College， Nanning 530000，China;3. Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530000，China

Abstract：Objective To explore the mechanism of Tongsai Xuanfei prescription in the treatment of pulmonary fibrosis （PF）. Methods 36 mouse were randomly divided into 6 groups， including model group， normal group， the positive drug group， Tongsai Xuanfei prescription high dose group，Tongsai Xuanfei prescription Middle-dose group and Tongsai Xuanfei prescription Low-dose group. Adopt the model of induce Pulmonary Fibrosis in mouse by disposable endotracheal injection of BLM （ bleomycin ） 6mg kg-1.d-1. Normal control group and model group were treated with normal saline. Hormone group was given subcutaneous of hydrocortisone while the rest groups were given corresponding medicines separately for 14 days after these models were established. 14 days after such intervention treatment， these 5 groups of mouse were killed to detect the lung tissue expression of IL-4，IL-10，TNF-α levels in each group rats by ELISA and observe the ultrastructure of the lung tissue through electron microscopy. Colorimetric method was used to measure the content of hydroxyproline （HYP） in lung. At the same time， to observe the spirit，activity and weight of all rats before and after molding and drug intervention.Results The expression levels of HYP， IL-4 and TNF-α in the high-dose group of Tongsaixuan Pills were significantly decreased （P<0.01）， and the low-dose group also had a certain effect（P<0.05）; IL-10 The expression of the content was significantly increased （P<0.01）， and the low-dose group also had a certain effect （P<0.05）. Tongsai Xuanfei prescription group could significantly relieved inflammation and restrained the degree of pulmonary fibrosis （P<0.01）. High-dose group is the best. Conclusion Tongsai Xuanfei prescription can inhibit the release of pro-inflammatory cytokines， exert anti-inflammatory effects， promote the degradation of extracellular matrix， and thus exert anti-pulmonary fibrosis effect. It has a certain preventive effect on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice.3A0B8894-9639-4E9B-B6A3-7AAD05FEE087

Key words：Tongsai Xuanfei Prescription Mixture; Bleomycin; Pulmonary Fibrosis

肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是現(xiàn)代醫(yī)學面臨的治療難題，作為慢性復雜類疾病之一，發(fā)病率和致死率都較高，其發(fā)病機制并不清楚，好發(fā)于中老年，生存周期短，生存質(zhì)量低^[1-2]。目前對于肺纖維化最有效的方法就是肺移植，但是肺移植手術(shù)價格昂貴，肺供體稀缺，在臨床上推廣使用較少。臨床實踐和現(xiàn)代試驗表明中醫(yī)藥對防治肺纖維化具有一定的優(yōu)勢，可以改善患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)將肺纖維化歸于“肺痿”“肺痹”“肺脹”等范疇^[3-5]。中醫(yī)認為肺間質(zhì)纖維化主要發(fā)病機制是氣虛血瘀、痰熱互結(jié)痹阻肺絡(luò)。通塞宣肺合劑由牛大力、黃芪、三七、芒果葉組成。牛大力、黃芪性溫而味甘，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有補氣潤肺之效;三七活血化瘀，芒果葉清熱祛痰止咳，全方共奏補肺益腎，止咳祛痰，活血化瘀之功。現(xiàn)代研究^[6-7]表明黃芪、三七、芒果葉對肺纖維化都有一定的干預作用。本研究通過觀察通塞宣肺合劑對博來霉素誘導的肺纖維化的炎癥因子影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡昆明種雄性小鼠，體重18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。合格證號：scxk桂2016-0002。

1.2 藥物與試劑 注射用鹽酸博萊霉素（批號：210082，日本化藥株式會社）;乙醚（批號：ws20050411，國藥集團化學試劑有限公司）;黃芪（批號：130901）、三七（批號130902）、芒果葉（自采）經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學中藥教研室覃文慧鑒定為正品。鹽酸（成都科龍化學試劑有限公司）;冰乙酸（AR）（上海國藥集團化學試劑有限公司）;地塞米松磷酸鈉注射液（批號：130608，廣州白云山天心制藥股份有限公司）。羥脯氨酸（HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;IL-4、TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 儀器 BX60顯微鏡（OLYMPUS）、TGL-16B和TGL-16C型高速臺式離心機、高速低溫離心機（Heraeus LG16-W）、全波長酶標儀（Epoch Biotek公司）、TU-1901/1900 紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、EL204電子天平（ 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、GZX-DH·400型電熱恒干燥箱（上海躍進公司）、HH·B11·360型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進公司）、BX-60型研究級顯微鏡（OLYMPUS ）、YQ-3勻漿器;德國Leitz1512型石蠟切片機;病理圖像分析儀（德國Leica公司）。

1.4 造模與分組 取6～8周健康昆明種雄性小鼠48只，隨機分為6組，每組8只，空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性組（地塞米松）、通塞宣肺合劑制劑高劑量組、通塞宣肺合劑制劑中劑量組、通塞宣肺合劑制劑低劑量組。各組小鼠乙醚麻醉后，仰位固定，用手托住小鼠呈直立狀，配合小鼠呼吸，從鼻腔緩慢滴入無菌鹽酸博萊霉素溶液（6 mg/kg），空白組滴入等量無菌生理鹽水，滴完后保持直立20 s，連續(xù)觀察14 d，小鼠出現(xiàn)咳嗽、乏力、冷顫現(xiàn)象，模型即建立完成。

1.5 實驗給藥 各組于造模14 d后開始相應的藥物干預，空白組和模型組采用生理鹽水（NS）灌胃，陽性組給予地塞米松（1 mg/kg）灌胃，其余各組每天分別給予通塞宣肺合劑高劑量組（5.00 mg/kg）、通塞宣肺合劑中劑量組（3.30 mg/kg）、通塞宣肺合劑低劑量組（1.65 mg/kg）灌胃。

1.6 觀察指標 各組小鼠分別于造模后第28天采集標本摘眼球取血后靜置析出血清后，于4 ℃離心機以3000 rpm離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y定指標用。打開小鼠胸腔，取出左側(cè)肺組織保存至-80 ℃冰箱，分別用 ELISA法檢測肺組織中白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子（TNF-α）含量水平，堿水解法測定肺組織中羥脯氨酸（HYP）的含量。操作按照試劑盒操作說明書進行。

肺右大葉固定于4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟處理，分別用HE和Masson染色觀察肺組織病理改變以及肺纖維化程度。HE染色病理切片（Szapiel方法）分為4級。I級（0分）：無肺泡炎癥;II級（1分）：輕度肺泡炎癥，單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的30%，肺泡結(jié)構(gòu)一般正常;III級（2～3分）：中度肺泡炎癥，受累面積占全肺的30%～70%，近胸膜部比較嚴重;IV級（4分）：重度肺泡炎癥，受累面積大于70%，偶然會見到肺泡腔內(nèi)有單核細胞和出血造成的實質(zhì)性變化。

Masson染色病理切片，將肺纖維化程度分4級。I級（0分）：無肺纖維化;II級（1分）：輕度肺纖維化，受累面積小于20%;III級（2分）：中度肺纖維化，受累面積占全肺的20%～50%;IV級（3分）：重度肺纖維化，受累面積大于50%，肺泡結(jié)構(gòu)比較紊亂。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。等級計數(shù)資料轉(zhuǎn)化為計量資料，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間差異進行單因素方差分析，P<0.01表示差異有顯著性統(tǒng)計學意義，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況 空白組小鼠皮毛健康無松散，具光澤，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)，未有咳嗽現(xiàn)象;模型組小鼠剛剛造模后會出現(xiàn)撓頭、躁動不安現(xiàn)象，隨著實驗的進行，體重會下降;精神萎靡不振;毛發(fā)松散，無光澤;呼吸困難、急促，偶有喘鳴聲，多有咳嗽;用藥組小鼠的一般狀況較模型組好。與空白組小鼠比較，模型組體重下降相對比較明顯（P<0.01），其余各組小鼠的體重均呈現(xiàn)出了不同程度的減輕;陽性組、通塞宣肺合劑高劑量組小鼠體重較模型組增加（P<0.05）。見表1、圖1。3A0B8894-9639-4E9B-B6A3-7AAD05FEE087

2.2 各組小鼠肺組織中HYP、IL-4 、IL-10、TNF-α的含量 通塞宣肺合劑高劑量組小鼠HYP、IL-4、TNF-α的表達水平顯著性地降低（P<0.01），中、低劑量組有所降低（P<0.05）;IL-10含量表達顯著性的增高（P<0.01），中、低劑量組有一定的效果（P<0.05）。見表2。

2.3 各組小鼠肺組織中TGF-β1mRNA的表達水平 通塞宣肺合劑高劑量組小鼠TGF-β1mRNA的表達水平顯著性地降低（P<0.0 1），中、低劑量組有所降低（P<0.05），低劑量組有一定的效果（P<0.05）。見表3。

2.4 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學觀察 光學顯微鏡下觀察，對照組肺結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮細胞、肺間質(zhì)血管上皮細胞未見或少見炎癥細胞浸潤，支氣管、肺泡、血管壁均未見膠原纖維明顯增生;肺泡炎癥與肺纖維化程度評分均為0分;模型組小鼠均有肺泡炎，表現(xiàn)為肺泡充血、水腫，部分肺泡有透明膜形成，肺泡上皮細胞有中至重度損傷，肺泡炎稍減輕;肺纖維化程度最重，多呈III級肺纖維化變化，膠原纖維組織增生、變厚，肺氣腫嚴重;肺泡炎癥與肺纖維化程度評分均為3分，與對照組比較，差異顯著（P<0.01）。各給藥組肺泡炎癥與肺纖維化程度均有明顯的改善，評分均為2分，與模型組比較，差異顯著（P<0.01）。肺組織病理學分析結(jié)果如圖1、圖2和表4所示。

3 討論

肺纖維發(fā)病機理復雜，臨床對肺纖維化的治療仍然是一個難題，中藥復方對防治肺纖維化具有一定的優(yōu)勢。通塞宣肺合劑是按照肺纖維化氣虛、血瘀、痰熱的機理組成的經(jīng)驗用方，由牛大力、黃芪、三七、芒果葉組成，牛大力、黃芪性溫而味甘，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有補氣潤肺之效;三七活血化瘀，芒果葉清熱祛痰止咳，全方共奏補肺益腎，止咳祛痰，活血化瘀之功。

肺纖維化是由于細胞外基質(zhì)和成纖維細胞過度沉積而導致肺組織結(jié)構(gòu)異常修復的一類疾病^[8-9]。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要有形成分，肺內(nèi)結(jié)締組織的成分絕大部分是膠原，它分布于肺泡壁、支氣管、胸膜和血管等所有肺組織中，因此膠原的異常沉積是肺纖維化的標志性改變^[10]。肺纖維化中由于細菌、病毒等多種致病因素的作用，導致肺泡炎癥細胞分泌多種生物活性物質(zhì)，誘導纖維母細胞合成、分泌大量的膠原成分，使得肺中膠原的合成速度大于降解速度，膠原纖維明顯增多，從而導致膠原的逐漸積累，以上構(gòu)成了肺纖維化的病理學基礎(chǔ)^[11]。而 HYP 是膠原中的一種特有的氨基酸，在膠原蛋白中含量約占 13%～14%，在彈性蛋白中占極少量，在其它蛋白中則不存在，因此當膠原代謝發(fā)生異常時，組織內(nèi) HYP 含量發(fā)生相應的變化，在膠原蛋白水平檢測方面，HYP的含量可作為特異性的判斷纖維化程度的指標^[12-13]。

TNF-α是TH1細胞分泌的促炎癥因子，可加速中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的增殖， 加速炎癥反應，加快肺纖維化的形成;TNF-α還能促進IL- 4的生成，激活成纖維細胞^[14-16]。實驗結(jié)果表明，通塞宣肺合劑能夠降低IL-4的含量，同時減少IL-10的水平，與模型組比較具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。通過對各組小鼠一般狀態(tài)觀察分析，用藥組小鼠體重、精神狀態(tài);毛發(fā)光澤和組織切片觀察HE染色、Masson染色觀察;呼吸狀況等方面較模型組好，從整體上反映出通塞宣肺合劑對肺纖維化小鼠有一定的治療作用。表明了通塞宣肺合劑能在一定程度地抑制炎性細胞浸潤，抑制膠原纖維的沉積，從而起到了防治肺間質(zhì)纖維化的作用，縮短了病變的進程，可以用于阻逆早期纖維化。

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（收稿日期：2021-08-20 編輯：劉 斌）3A0B8894-9639-4E9B-B6A3-7AAD05FEE087