二補助育湯對胚胎著床障礙小鼠子宮血管生成相關因子表達的影響

周雨玫 劉雁峰 申萌萌

摘要 目的：探討二補助育湯對胚胎著床障礙模型小鼠子宮內膜形態及血管生成素-1（Ang-1）mRNA、血管內皮生長因子（VEGF）mRNA的表達和定位的影響。方法：24只ICR雌性小鼠隨機分為空白組、模型組、戊酸雌二醇組、二補助育湯組，每組6只，用米非司酮建立胚胎著床障礙動物模型，各組給予相應藥物灌胃，妊娠第5天處死小鼠后，檢測各組妊娠率、平均著床位點數、子宮內膜Ang-1和VEGF mRNA表達量及其蛋白定位。結果：模型組小鼠平均胚胎著床位點數、Ang-1 mRNA、VEGF mRNA表達量明顯低于空白組（均 P <0.05）;與模型組比較，二補助育湯組平均胚胎著床位點數、Ang-1 mRNA、VEGF mRNA表達量顯著提高（均 P <0.05）。結論：二補助育湯可提高子宮內膜Ang-1和VEGF蛋白表達量，促進子宮內膜血管生成，從而提高子宮內膜容受性。

關鍵詞 二補助育湯;胚胎著床障礙小鼠;血管生成;血管生成素-1;血管內皮生長因子;子宮內膜容受性;妊娠率;平均胚胎著床位點數

Influence of Erbu Zhuyu Decoction on the Expression of Uterine Angiogenesis-related Factors in the Endometrium of Mice with Embryo Implantation Dysfunction

ZHOU Yumei1，LIU Yanfeng1，SHEN Mengmeng2

（1 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China）

AbstractObjective： To investigate the influence of Erbu Zhuyu Decoction on the expression of angiopoietin-1（Ang-1） and vascular endothelial growth factor（VEGF） in the endometrium of mice with embryo implantation dysfunction. Methods： Female ICR mice（n=24） were randomly assigned into a blank group，a model group，an Erbu Zhuyu Decoction group，and a progynova group（each n=6）.Mifepristone was used to establish the model of embryo implantation dysfunction.The mice in different groups were orally administrated with corresponding agents each day and sacrificed in the afternoon of the 5th day of pregnancy.The morphology of uterus was observed，and the pregnancy rate and average number of embryo implantation sites were calculated.The mRNA levels and protein localization of Ang-1 and VEGF were determined. Results： Compared with the blank group，the modeling decreased the embryo implantation sites（ P <0.05） and down-regulated the mRNA levels of Ang-1 and VEGF（ P <0.05）.Compared with the model group，Erbu Zhuyu Decoction increased the embryo implantation sites（ P <0.05） and up-regulated the mRNA levels of Ang-1 and VEGF（ P <0.05）. Conclusion： Erbu Zhuyu Decoction can up-regulate the mRNA levels of Ang-1 and VEGF to improve the blood supply and promote the receptivity of endometrium，thereby facilitating embryo implantation.

Keywords Erbu Zhuyu Decoction; Mouse model of embryo implantation dysfunction; Angiogenesis; Angiopoietin-1; Vascular endothelial growth factor; Endometrial receptivity; Pregnancy rate; Average number of embryo implantation sites

中圖分類號：R243;R271.14 文獻標識碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.013132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F

子宮內膜容受性（Endometrial Receptivity，ER）是指子宮內膜在特定時期對胚胎表達出接受著床的狀態[1]。胚胎著床需要充足的血管生長和維持，過程中伴隨子宮內膜組織生成豐富的血管[2]，以提供營養支持。充足的子宮血管和調節細胞因子是胚胎成功著床的必要條件，子宮內膜血管生成和細胞因子表達的下降會導致生殖失敗[3]。血管生成主要受兩大關鍵生長因子家族調節：血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）家族和血管生成素（Angiopoietin，Ang）家族[4]，兩家族共同合作誘導血管的生長[5]。研究表明，Ang-1和VEGF在種植窗期子宮組織及早期胎盤中出現高表達，提示Ang-1和VEGF可能參與胚胎植入過程[6]。故調控血管生成的Ang、VEGF家族可能影響子宮內膜容受性。二補助育湯是北京中醫藥大學東直門醫院名老中醫肖承悰教授治療子宮內膜容受性不良的經驗用方，可明顯提高子宮內膜容受性不良患者體外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization Embryo Transfer，IVF-ET）的成功率[7]。本實驗在前期研究的基礎上，試從血管生成角度出發，探討二補助育湯對血管生成相關基因Ang-1和VEGF的影響，進一步研究其改善子宮內膜容受性的作用機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物6～8周齡未交配過無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級ICR雌性小鼠24只，體質量（25±2）g;7～9周齡有生育能力SPF級ICR雄性小鼠12只，體質量（25±2）g，購自北京維通利華實驗技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有動物由北京中醫藥大學動物房負責飼養，自由獲取食物和飲水，飼養環境溫度為（22±2）℃，濕度為5% ～10%，光照周期12 h/12 h。本研究經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批通過（倫理審批號：BUCM-4-2020110203-4105）。

1.1.2藥物二補助育方由骨碎補15 g、補骨脂15 g、巴戟天15 g、桑寄生15 g、川續斷15 g、川牛膝15 g等藥物組成，由北京康仁堂藥業有限公司制作出顆粒制劑。用0.5%羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl Cellulose，CMC）溶液加熱攪拌溶解，制成質量濃度為3 g/mL的混懸液;戊酸雌二醇（Bayer公司，德國，進口藥品注冊證號：H20160679，批號：502A）。取1.5 mg放在研缽中研碎，溶于0.5% CMC溶液中，攪拌均勻，制成濃度為0.03 mg/mL溶液;米非司酮片（華潤紫竹藥業有限公司，批號：43190503）研碎后藥末溶于麻油中配制成質量濃度為0.68 g/mL的米非司酮油劑。

1.1.3試劑與儀器4%多聚甲醛（SPI公司，英國，貨號：#2615）;anti-VEGF（北京中杉金橋公司，貨號：ZA-509）;Ang-1 Polyclonal Antibody（Abbkine公司，美國，貨號：ABP53096）;兔超敏即用型二步法<非生物素>檢測試劑盒[北京中杉金橋公司，貨號：PV-9001（GBI）];SsoAdvancedTM SYBR Green Supermix熒光定量PCR（Bio-Rad公司，美國，貨號：Cat#A5000）。熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國，型號：CFX96）;光學顯微鏡（OLYMPUS公司，日本，型號：Olympus BX60）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備所有小鼠適應性飼養1周后，每日16：00時合籠，雌雄比例2∶ 1，次日8：00發現陰栓者認定為妊娠，記為妊娠第1天。將妊娠小鼠按照隨機數字表分為4組：空白組、模型組、戊酸雌二醇組、二補助育湯組，每組6只。分別予以相應藥物灌胃。妊娠第4天9：00，模型組、戊酸雌二醇組、二補助育湯組于小鼠后頸部皮下注射米非司酮油劑，注射量為0.1 mL/只，制成胚胎著床障礙模型;空白組同時間注射麻油，注射量為0.1 mL/只。

1.2.2給藥方法空白組和模型組小鼠于妊娠第1天開始每天灌服0.5% CMC溶液，其余各組灌服相應藥物（二補助育湯組、戊酸雌二醇組小鼠給藥量分別相當于臨床體質量70 kg的成人每日劑量160 g、2 mg）灌胃量按0.1 mL/10 g計算，連續灌胃5 d。各組小鼠于妊娠第5天下午脫頸處死，無菌條件下快速摘取子宮，其中一角子宮迅速放入凍存管中液氮中冷凍，-80 ℃保存，備PCR檢測;另一角子宮投入4%多聚甲醛溶液中固定，備蘇木精-伊紅（Hematoxylin Eosin，HE）染色及免疫組織化學檢測。

1.2.3檢測指標與方法1）觀察各組小鼠子宮大體形態;2）妊娠率及平均著床位點數：記錄各組小鼠妊娠數量及每只小鼠著床位點數。妊娠率（%）=妊娠小鼠數/該組雌鼠數×100%;平均著床位點數（%）=總胚泡數/該組妊娠小鼠數×100%;3）光鏡下子宮內膜形態：采用HE染色法，觀察子宮組織的形態結構。操作步驟如下：石蠟包埋，4 μm厚切片，脫蠟，沖洗5 min，蘇木精染色15 min，水洗，5%伊紅染色5 min，沖洗5 min，乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片;4）免疫組織化學法檢測各組小鼠子宮內膜中Ang-1、VEGF的表達：4%多聚甲醛固定24 h后進行病理制片，乙醇逐級脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、4 μm厚切片，常規脫蠟至水，3% H2O2 10 min，抗原修復10 min，一抗4 ℃過夜，二抗、三抗37 ℃ 30 min，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、二甲苯透明、樹脂膠封固，顯微鏡觀察;5）子宮內膜Ang-1、VEGF mRNA的表達：取各組小鼠子宮內膜組織100 mg，Trizol法提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA完整性，反轉錄為cDNA后，進行RT-PCR，內參為GAPDH。Ang-1：上游引物5′-CAGCATCCTGCAGAAGCAAC-3′，下游引物5′-TCTCTTTTTCCTCCCTTTAGCA-3′，擴增片段99 bp;VEGF：上游引物5′-TATTCAGCGGACTCACCAGC-3′，下游引物5′-CCTCCTCAAACCGTTGGCA-3′，擴增片段150 bp。反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。基因表達量采用相對定量2-△△Ct法進行計算。132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F

1.3統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（ ?±s ）表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法。不滿足正態分布或方差齊性，用非參數檢驗。以 P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1子宮形態空白組小鼠子宮顏色淡紅，胚胎著床處子宮膨大，呈串珠狀改變，血管豐富;模型組小鼠子宮顏色蒼白，管腔較細，胚胎著床數目極少，分布稀疏，著床處膨大較空白組小，血管稀疏;戊酸雌二醇組小鼠子宮顏色黃白，管腔形態短粗，胚胎著床數目少，分布稀疏且不均勻;二補助育湯組小鼠子宮顏色淡紅，管腔細長，胚胎著床數目較多，分布均勻呈串珠狀改變，血管豐富。見圖1。

2.2妊娠率及平均著床位點數與空白組比較，模型組平均胚胎著床位點數減少，差異有統計學意義（ P <0.05），胚胎著床障礙模型造模成功;與模型組比較，二補助育湯組與戊酸雌二醇組平均著床位點數明顯增多，差異有統計學意義（均 P <0.05）;與戊酸雌二醇組比較，二補助育湯組平均著床位點數略有增多，差異無統計學意義（ P >0.05）。見表1，圖2～3。

2.3子宮內膜HE染色空白組子宮內膜腔上皮增厚，呈假復層改變;子宮間質稀疏，呈蛻膜化表現;腺體、血管豐富。模型組子宮內膜厚度變薄，腺體、血管數量較空白組減少。戊酸雌二醇組子宮內膜較模型組有明顯改善，腺體表達豐富，但血管較少。二補助育湯組子宮內膜較模型組增厚，間質內腺體、血管表達豐富。見圖4。

2.4子宮內膜Ang-1蛋白定位及mRNA表達

空白組Ang-1蛋白在子宮內膜間質、血管上皮細胞中表達陽性。模型組VEGF蛋白在子宮內膜血管上皮細胞上表達弱陽性，在間質細胞上表達陰性。戊酸雌二醇組和二補助育湯組Ang-1蛋白定位與空白組相接近。見圖5。

與空白組比較，模型組小鼠子宮內膜Ang-1 mRNA表達量減少（ P <0.05）;與模型組比較，戊酸雌二醇組和二補助育湯組小鼠子宮內膜Ang-1 mRNA表達量均升高，且差異均有統計學意義（均 P <0.05）。見表2，圖6。

2.5子宮內膜VEGF蛋白定位及mRNA表達

空白組VEGF蛋白在子宮內膜腔上皮、血管上皮、腺體上皮、間質細胞上陽性表達。模型組VEGF蛋白在子宮內膜腔上皮、血管上皮、腺體上皮細胞上表達弱陽性，在間質細胞上表達陰性。戊酸雌二醇組和二補助育湯組VEGF蛋白定位與空白組相接近。見圖7。

與空白組比較，模型組小鼠子宮內膜VEGF mRNA表達量減少（ P <0.05）;與模型組比較，戊酸雌二醇組和二補助育湯組小鼠子宮內膜VEGF mRNA表達量均升高，且差異均有統計學意義（均 P <0.05）。見表3，圖8。

3討論

北京中醫藥大學東直門醫院肖承悰教授治療子宮內膜容受性不良選用經驗方二補助育湯加減。肖教授認為腎虛血瘀、心血不足、胞脈不暢為該病的主要病機，立“補腎氣、通胞脈”治法，臨床療效顯著。方由骨碎補、補骨脂、巴戟天、桑寄生、川續斷、川牛膝等藥物組成，方名中“二補”為君藥骨碎補、補骨脂，二藥合用補腎助孕，溫陽活血;巴戟天補腎益精，助君藥補腎助陽;桑寄生、川續斷補腎益精，活血通脈，溫而不燥，補而不膩;川牛膝補腎氣、通血脈，引諸藥下行于胞中。方中補腎藥物與活血行氣藥物靈活配伍，補而不滯，共奏補腎、溫陽、活血、通脈之功。團隊前期臨床研究表明，二補助育湯能改善患者臨床癥狀，提高再次IVF-ET的成功率及臨床妊娠率，可從增加子宮內膜厚度、降低子宮動脈及內膜血流值、提高Salle評分、糾正母體血栓前狀態等方面提高子宮內膜容受性[7-9]。前期實驗研究表明，該方可通過改善子宮內膜胞飲突表達、提高子宮內膜雌激素受體、孕激素受體、白細胞抑制因子、整合素ανβ3、干細胞因子mRNA、HOXA-10 mRNA的表達、激活磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase-Protein Kinase B，PI3K/AKT）/內皮型一氧化氮合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）通路、增加自噬相關標志物Beclin-1、LC3B的表達來改善子宮內膜容受性[10-15]。

米非司酮和吲哚美辛是目前研究較成熟的胚胎著床障礙動物模型建立用藥。米非司酮是一種孕激素拮抗劑，具有抗早孕作用，其機制是與孕激素受體競爭性結合從而達到抗孕酮的效果。米非司酮可引起前列腺素（Prosglandins，PGs）大量釋放、抑制黃體生成素分泌、從而導致流產、抗排卵及胚胎著床[16]。研究表明，米非司酮可抑制子宮內膜Ang-1、VEGF的表達，阻礙子宮內膜血管正常生成，造成子宮內膜容受性降低[17]。吲哚美辛可通過抑制PGs合成酶環氧合酶（Cyclooxygenase，COX）的表達，降低PGs的含量，阻礙VEGF的表達，使子宮內膜血管生成受到抑制，血管通透性降低，子宮內膜不能正常蛻膜化，達到阻礙胚胎著床的作用[18]。米非司酮和吲哚美辛雖都具有抗著床效應，都能夠復制穩定的胚胎著床障礙模型，但吲哚美辛具有強烈的抗炎作用，對全身其他系統都有不良影響，易造成動物損傷甚至死亡，而米非司酮未表達出對其他各系統有明顯不良反應，且具有給藥次數少、劑量小的優點，故本研究選用米非司酮建立胚胎著床障礙動物模型。一般情況下，發育正常的小鼠胚胎在母鼠妊娠第4天到達宮腔，在子宮內膜著床的時間約為妊娠第4.5天[19]。據此，本研究于小鼠妊娠第4天頸部皮下注射米非司酮油劑，通過抑制子宮內膜血管生成，造成胚胎著床障礙模型[20]。戊酸雌二醇常作為在IVF-ET周期中雌激素補充治療用藥，可修復受損的子宮內膜，提高移植后的子宮內膜容受性[21]，故本研究選用戊酸雌二醇作為陽性對照藥物。132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F

維持子宮內膜發育、支持胚胎著床常伴有內膜血管的生長和消退，故血管生成已成為評價子宮內膜容受性的重要參考依據[22]。近年來發現Ang家族成員之一Ang-1參與調節血管生成及其穩定性。研究表明，Ang-1基因在胚胎著床時期的子宮內膜中過表達，參與著床部位的血管新生與重塑，對囊胚成功著床有重要意義[23]。VEGF參與血管生成，影響血管通透性，可促進新生血管的發生和生長，有助于胚胎早期絨毛血管的形成，利于胚胎著床。圍著床期VEGF的過表達可促使子宮內膜容受性增加[24]。VEGF和Ang保持動態平衡，VEGF促使血管內皮細胞分裂增殖，加快血管生成;血管生成后，Ang可增強新生血管穩定性，其中Ang-1在血管生成后期通過降低血管通透性，增加新生血管穩定性[25-26]。而Ang-1還可與VEGF共同抑制血管內皮細胞凋亡，降低血管通透性，抑制炎癥反應，聯合作用保護血管[27]。

本研究通過檢測子宮內膜組織中Ang-1 mRNA與VEGF mRNA的表達，評估小鼠子宮內膜血管生成水平。實驗結果表明，米非司酮可造成小鼠子宮內膜變薄，抑制子宮內膜Ang-1 mRNA與VEGF mRNA表達，導致小鼠子宮內膜血管生成障礙，容受性下降，妊娠率及平均著床位點數降低。Ang-1 mRNA與VEGF mRNA主要在子宮內膜血管上皮細胞及血管周圍的間質細胞中表達，戊酸雌二醇和二補助育湯能夠提高二者的表達水平，提示二補助育湯可通過促進子宮內膜血管生成提高子宮內膜容受性。

綜上所述，二補助育湯能夠提高子宮內膜Ang-1 mRNA、VEGF mRNA的表達，提高妊娠率，增加胚胎著床位點數，其機制可能是通過促進子宮內膜血管生成，改善胚胎著床處血供，從而提高子宮內膜容受性。

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（2021-03-30收稿本文編輯：楊燕）

基金項目：國家自然科學基金項目（82074480）作者簡介：周雨玫（1993.04—），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫藥防治女性生殖內分泌紊亂疾病、不孕癥等，E-mail：zhouyumeibucm@163.com通信作者：劉雁峰（1963.02—），女，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：中醫藥防治女性生殖內分泌紊亂疾病、不孕癥等，E-mail：liuyaf8888@sina.com132E811B-59F1-4B75-AC56-5F39F1BE546F