針刺對膠原誘導性關節炎大鼠胃腸動力的影響

談倩 李佳 李靜 李柏村 向宏春 蔡國偉

摘要 目的：利用制備的膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠模型，探討針刺足三里對CIA大鼠胃腸動力的影響。方法：將60只12周齡雄性大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、電針組、手針組，每組15只，建立牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑誘導CIA大鼠模型。電針組和手針組于造模完成后第1天取足三里穴治療，15 min/次，1次/d，連續治療14 d。在3 d，7 d，14 d時，采用跖圍法測大鼠跖圍長度，并在治療14 d后，用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察膝關節的病理學變化，計算大鼠的胃排空率和腸推進率，結腸蠕動波測定方法檢測大鼠的腸蠕動波次數，通過蛋白質免疫印跡法檢測胃黏膜中促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）和血管活性腸肽（VIP）的表達。結果：與正常組比較，模型組大鼠跖關節腫脹明顯（ P <0.01），軟骨組織破壞嚴重并有炎癥細胞浸潤，胃排空率和腸推進率均降低（ P <0.01），胃黏膜中CRF和VIP表達明顯增多（ P <0.01）。與模型組比較，針刺后大鼠跖關節腫脹程度明顯降低（ P <0.05），軟骨破壞程度減輕和炎癥細胞浸潤明顯減少，胃排空率和腸推進率提升（ P <0.05），腸蠕動波次數增加，胃黏膜中CRF和VIP表達量減少（ P <0.05），其中手針干預效果最為顯著。結論：針刺足三里對CIA大鼠的腸動力障礙具有調節作用，并且手針組療效優于電針組治療。

關鍵詞 針刺;手針;足三里;類風濕關節炎;胃腸動力;內臟敏感性;促腎上腺皮質激素釋放因子;血管活性腸肽

Effect of Acupuncture at Zusanli（ST 36） on Gastrointestinal Motility in Rats with Collagen-induced Arthritis

TAN Qian1，LI Jia2，LI Jing1，LI Bocun1，XIANG Hongchun1，CAI Guowei1

（1 Department of Acupuncture and Moxibustion，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China; 2 Hubei Provincial Collaborative Innovation Center of Preventive Treatment by Acupuncture and Moxibustion，College of Acupuncture and Orthopedics，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430061，China）

AbstractObjective： To investigate the effect of acupuncture at Zusanli（ST 36） on gastrointestinal motility in the rats with collagen-induced arthritis（CIA）. Methods： Sixty healthy Sprague-Dawley（SD） rats aged 3 months were randomly assigned into four groups：normal group，model group，electroacupuncture group，and hand acupuncture group，with 15 rats in each group.Electroacupuncture and hand acupuncture were respectively carried out at Zusanli（ST 36） for 15 min once a day for 14 days since the first day after modeling.On days 3，7，and 14，plantar circumference of each rat was measured.At the end of treatment，the pathological changes of knee joints were observed by hematoxylin-eosin（HE） staining.The gastric emptying rate and intestinal propulsion rate were calculated，and the frequency of peristaltic waves in intestine was detected.The expression of corticotropin-releasing factor（CRF） and vasoactive intestinal peptide（VIP） in gastric mucosa was measured. Results： Compared with the normal group，the modeling caused the swelling of plantar joint（ P <0.01），severe damage of cartilage tissue，and infiltration of inflammatory cells，decreased the gastric emptying rate and intestinal propulsion rate（ P <0.01），and up-regulated the expression levels of CRF and VIP in gastric mucosa（ P <0.01）.Compared with the model group，the acupuncture at Zusanli（ST 36） alleviated the plantar joint swelling（ P <0.05），cartilage damage，and inflammatory cell infiltration，increased the gastric emptying rate and intestinal propulsion rate（ P <0.05），accelerated intestinal peristalsis，and down-regulated the expression of CRF and VIP in gastric mucosa（ P <0.05）.In particular，hand acupuncture demonstrated better performance. Conclusion： Acupuncture at Zusanli（ST 36） can regulate intestinal motility disorder in CIA rats，and hand acupuncture has better therapeutic effect than electroacupuncture.843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

Keywords Acupuncture; Hand acupuncture; Zusanli（ST 36）; Rheumatoid arthritis; Gastrointestinal motility; Visceral sensitivity; Corticotropin-releasing factor; Vasoactive intestinal peptide

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.014

類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是最普遍的慢性炎癥性疾病之一，它主要累及關節，但該疾病應被認為是一種包括關節外表現的綜合征[1]，在其發生發展的過程中，常累及體內多個臟器，從而表現出全身癥狀[2]，例如風濕性心臟病、血管炎、胃腸功能紊亂等，其中RA所導致的消化系統問題也得到越來越多學者的關注[3]。目前，導致RA并影響疾病嚴重程度和發病的機制尚不明確，因此，當前治療RA策略主要是減輕癥狀而不是治療病因。在疾病早期通常選用抗風濕類藥物，非甾體抗炎藥，糖皮質激素等來控制病情[4]，但這些藥物需要長期服用，并會導致許多不良反應，而這些藥物的不良反應最常發生在胃腸道，引起胃腸功能紊亂，導致嘔吐、腹痛、胃出血等癥狀。

因此，胃腸功能紊亂已成為風濕病臨床常見問題之一，如何改善RA局部疼痛和胃腸功能問題，并減少治療中的不良反應，是目前研究的重點。針灸是中醫特色療法之一，作為補充與替代療法，針灸在治療各類疼痛以及提高患者生命質量等方面具有較大優勢，特別是在治療關節疼痛、調節胃腸功能以及各種慢性代謝性疾病方面[5]。研究表明，針灸對于RA的局部癥狀有明顯的改善作用并提高患者的生命質量，但尚未說明其是否能改善由RA所引起的胃腸道問題[6]。因此，在前期研究針灸防治類風濕關節炎和胃腸疾病實驗研究基礎上[7-9]，我們采用單穴足三里，探討針刺對RA關節的保護以及胃腸動力的調節作用，初步觀察其作用機制，為針刺在RA胃腸動力障礙方面的臨床應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物

選取12周齡無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級雄性SD大鼠60只，動物喂養在湖北中醫藥大學實驗動物中心完成，生產合格證號：SCXK（鄂）2020-0018號，環境溫度21～25 ℃，濕度40% ～60%。光照時間每日12 h，大鼠可自由取食飲水。本實驗嚴格遵守中華人民共和國科技部[2006]398號文件《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。

1.1.2主要試劑及儀器

Φ0.30 mm×13 mm華佗牌毫針（蘇州醫療器械廠，貨號：30255209574），電針治療儀（上海華誼醫用儀器有限公司，型號：G6805）;顯微鏡（ZWISS，德國，型號：Axiovert 40CFL），化學發光成像系統（Bio-Rad，美國，型號：ChemiDoc XRS+），電泳儀（Bio-Rad，美國，型號：164-5052），轉膜儀（Bio-Rad，美國，型號：1704150）;牛Ⅱ型膠原（SIGMA公司，美國，貨號：234184-M），弗氏不完全佐劑（SIGMA公司，美國，貨號：F5506），CRF抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab184238），VIP抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab227603），β-actin抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab8227）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備適應性喂養1周后，隨機數字表法分為4組，正常組、模型組、電針組，手針組，每組15只，其中每組選5只用于病理切片：蘇木精-伊紅（Hematoxylin Eosin，HE）染色，5只用于胃腸動力檢測，另外5只用于蛋白免疫印跡法檢測。參考文獻[10]，將牛Ⅱ型膠原溶于0.5 mol/L醋酸，在4 ℃環境中溶化并過夜，制成終濃度為2 mg/mL溶液，再與等量弗氏不完全佐劑在冰浴下充分乳化制成乳劑，每只大鼠以0.1 mL乳劑的量，在足底部作皮內注射接種誘發免疫反應，7 d后將牛Ⅱ型膠原與等量弗氏不完全佐劑配制成劑，每只大鼠以0.1 mL的量注射于大鼠尾巴根部多點加強免疫，再次免疫14 d后造模完成。實驗過程中可見各造模完成后的大鼠表現為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或出現炎癥結節，提示造模成功。

1.2.2干預方法于造模完成后采用針灸干預，參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜”，選取雙側后三里，即大鼠的足三里穴，位于膝關節下外側的腓骨小頭下方約5 mm處。電針組：大鼠足三里穴位針刺深度約5 mm，連接電針治療儀，選用頻率2 Hz，強度為1 mA的連續波，持續時間15 min，1次/d，共治療14 d。手針組：大鼠足三里穴位針刺深度約5 mm，行手法行針，平補平瀉，頻率約120次/min，強度以大鼠耐受為度，每隔4 min行針1 min，共留針15 min，1次/d，共治療14 d。正常組和模型組均不處理。

1.2.3檢測指標與方法

跖圍法測量大鼠足跖腫脹度：以造模前為基線，分別測量干預時間段的3 d，7 d，14 d大鼠跖圍，各組大鼠在同一時間用手術線環繞大鼠右下足跖部相應骨性標志處測量長度，每只大鼠每次分別測量3次取其平均值。

HE染色法觀察膝關節病理形態：大鼠頸椎脫臼處死，將膝關節標本用4%多聚甲醛固定液固定，脫鈣后，常規蠟塊包埋，制作4 μm厚石蠟切片，經過脫蠟、染色、脫水、透明和封片的步驟后，在光學顯微鏡下觀察軟骨組織。

計算胃排空率檢測胃動力：大鼠取材前24 h禁食不禁水，提前稱取W1的黑色半固體糊狀物（由羧甲基纖維素鈉、奶粉、糖、淀粉、碳素墨水加蒸餾水配制成）進行灌胃，半固體糊濃度為1 g/mL，每只灌胃0.8 mL，30 min后，開腹取胃和小腸，分別記錄胃總重W2和胃凈重W3，胃排空率=[1-（W2-W3）/W1]×100%。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

計算腸推進率檢測腸動力：同“計算胃排空率檢測胃動力”處理取材，記錄小腸全長L1及黑色半固體推進距離L2，計算公式如下，小腸推進率=L2/L1×100%。

腸蠕動波測定法檢測大鼠腸蠕動波次數：以2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg體質量）尾靜脈注射麻醉大鼠，體溫維持37.5 ℃左右，將自制的結直腸擴張刺激球囊插入大鼠肛門內，記錄單位時間（30 min）內的腸蠕動波個數。

蛋白質免疫印跡法測定胃黏膜組織中促腎上腺皮質激素釋放因子（Corticotropin Releasing Factor，CRF）和血管活性腸肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）的表達水平：在冰上取胃組織后，提取蛋白并進行濃度測定，配制12% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行電泳、轉膜、封閉、孵育一抗（4 ℃，過夜），孵育二抗后加入ECL發光液顯影，使用化學發光成像系統進行掃描，運用Image J 軟件分析目的蛋白條帶CRF、VIP相對灰度值，其中肌動蛋白作為內參。

1.3統計學方法

采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進行統計分析和繪制圖表，數據以均數±標準差（ ?±s ）表示，符合正態分布且方差齊性組間比較采用單因素方差分析，不符合正態分布采用秩和檢驗，方差不齊性采用Dunnett′s T3檢驗，率的顯著性比較采用χ2檢驗，以 P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1針刺對大鼠跖圍的影響造模前，各組大鼠跖圍測量結果比較差異無統計學意義（均 P >0.05），造模完成后3 d，模型組、手針組和電針組大鼠的跖圍均發生腫脹，腫脹程度明顯高于正常組，差異有統計學意義（均 P <0.05）;治療后7 d，手針組和電針組的大鼠跖圍減小，腫脹程度顯著低于模型組（均 P <0.01），其中手針組的大鼠跖圍改變更為明顯;在治療后14 d，手針組與電針組比較，差異有統計學意義（ P <0.05）。見圖1。

2.2針刺對CIA大鼠模型的膝關節的影響正常組大鼠的關節面光滑，軟骨細胞排列整齊，而模型組關節面有破損，軟骨表層破損，細胞增生明顯，周圍有炎癥細胞浸潤，而手針組和電針組大鼠的膝關節面較模型組而言破損較少，破損程度輕，軟骨細胞表面較光滑，并且手針組效果優于電針組。見圖2。

2.3針刺對胃腸動力的影響模型制備過程中，大鼠出現食欲減退，體質量增加較正常組減少。與正常組比較，模型組大鼠胃排空率和腸推進率顯著降低，且蠕動波次數減少（均 P <0.05）;治療后，手針組和電針組大鼠胃排空和腸推進率有所提升，腸蠕動波顯著增加、胃腸蠕動變快，與模型組比較差異有統計學意義（均 P <0.05），其中手針組大鼠胃腸動力改變最為明顯，與電針組比較差異有統計學意義（ P <0.05）。見圖3～5。

2.4針刺對胃黏膜組織中的CRF、VIP表達的影響與正常組比較，模型組大鼠的胃黏膜組織中的CRF、VIP表達水平顯著升高，差異有統計學意義（均 P <0.01）;與模型組比較，手針組與電針組的大 鼠胃黏膜組織中的CRF、VIP水平顯著降低，差異有

3討論

RA是一種自身免疫性炎癥性風濕性疾病，會影響多個組織和器官并引起慢性滑膜炎癥，最終導致關節破壞，慢性殘疾甚至是減短壽命[11]。中醫的類風濕性關節炎屬于“尪痹”“痹證”，中醫認為其發病機制多與脾胃虛弱，陽氣不足，衛外無力，風寒濕火等毒邪入侵，流于經絡，機關不利有關[12]。足三里是治療RA的常用穴位之一[13]。《針灸大成·治病要穴》中云：“足三里：主中風中濕，諸虛耳聾，上牙疼，痹風，水腫，心腹鼓脹，噎膈哮喘，寒濕腳氣。上、中、下部疾，無所不治。”[14]足三里為多氣多血之足陽明經合穴，有調理脾胃、通暢氣機、通經活絡之功效。本研究發現，針刺足三里后，CIA大鼠的跖圍腫脹程度明顯降低，并且其膝關節的HE染色結果也顯示，其關節面的破損程度和炎癥細胞浸潤顯著減輕，而手針的治療效果要優于電針治療，說明針刺足三里可以改善CIA大鼠的局部炎癥癥狀，并減輕關節疼痛和腫脹，這與我們前期的實驗研究結果一致[15]。同時，我們發現CIA大鼠存在明顯的胃腸道問題，特別是對胃腸動力的影響，在模型組中胃排空率和腸推進率明顯降低，腸蠕動波減少，說明其胃腸蠕動減慢，胃腸動力減弱。CRF是一種重要的神經內分泌肽，并且是介導應激反應的關鍵性調節因子[16]，參與抑制副交感神經和提高交感神經活動，在一定程度上可以反映內臟敏感性[17]。而VIP是一種腸肽激素，具有調節胃腸道的離子分泌、營養吸收和腸蠕動等作用[18]，本研究發現，模型組CRF、VIP的表達明顯增多，進一步說明了CIA大鼠存在內臟敏感性提高和胃腸道功能障礙的問題。而在針刺足三里后，胃排空率和腸推進率顯著提高以及腸蠕動波明顯增多，并且胃黏膜組織中的CRF和VIP含量也顯著降低，說明針刺足三里可調節CIA大鼠的胃腸動力，改善胃腸蠕動并且降低內臟敏感性。在之前RA的研究中，并未涉及到針灸對于其胃腸動力的調節作用，而我們選用針刺治療RA不僅反映其對局部關節炎具有調節作用，同時也為RA所發生的胃腸動力問題提供了新的治療思路。

RA與胃腸道關系緊密，并提出腸-關節軸的理論假說[19-20]，認為胃腸道疾病與RA的發病是相互影響的關系。有研究發現在RA患者的腸道微生物群中檢測其多樣性降低、微生物失調，但在RA治療后可部分緩解[21]。同時有學者發現腸道營養不良會觸發黏膜免疫反應，從而刺激T和B細胞，進一步促進炎癥性關節炎的發展[22]。并且RA中許多與免疫相關的異常都發生在黏膜水平，在RA的發展過程中，腸黏膜免疫反應被放大，抗原呈遞細胞被異常激活，免疫耐受受到干擾[23]，從而引起胃腸道反應。據臨床報道，RA患者不僅出現吞咽困難，燒心、反酸的食管反流臨床表現，而且可因小腸蠕動減慢，出現飽腹感，惡心、嘔吐、胃痙攣、餐后腹痛或腹脹等內臟敏感性增強[24]。足三里位于膝關節局部，針刺足三里可以調節局部關節炎癥反應[25]。并且足三里作為調理脾胃的要穴，也常用于治療胃腸系統疾病，并在動物實驗和臨床試驗中均證實其有改善胃腸動力和調節內臟敏感性的作用[26-27]。基于此，我們研究了針刺足三里是否能夠改善RA的局部關節癥狀以及其導致的胃腸動力問題。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

綜上可見，針刺足三里不僅緩解了CIA大鼠的關節疼痛及腫脹癥狀，同時也改善了CIA大鼠引起的胃腸動力問題，對機體整體具有較好的調節作用。而這一實驗思路，也為臨床治療RA提供了新的途徑。但是RA和胃腸動力如何進行聯系仍不明確，其治療的具體機制也有待進一步研究。

參考文獻

[1] Firestein GS，McInnes IB.Immunopathogenesis of Rheumatoid Arthritis[J].Immunity，2017，46（2）：183-196.

[2]Klareskog L，Rnnelid J，Saevarsdottir S，et al.The importance of differences; On environment and its interactions with genes and immunity in the causation of rheumatoid arthritis[J].J Intern Med，2020，287（5）：514-533.

[3]Horta-Baas G，Romero-Figueroa M，Montiel-Jarquín AJ，et al.Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis：A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis[J].J Immunol Res，2017，2017：4835189.

[4]黃淑敏，鐘森杰，廖曉倩，等.基于中西醫臨床病癥特點的類風濕性關節炎動物模型分析[J].中國中藥雜志，2021，46（19）：5152-5158.

[5]van den Berg-Wolf M，Burgoon T.Acupuncture and Cutaneous Medicine：Is It Effective？[J].Med Acupunct，2017，29（5）：269-275.

[6]Seca S，Miranda D，Cardoso D，et al.Effectiveness of Acupuncture on Pain，Physical Function and Health-Related Quality of Life in Patients with Rheumatoid Arthritis：A Systematic Review of Quantitative Evidence[J].Chin J Integr Med，2019，25（9）：704-709.

[7]蔡國偉，李柏村，李佳，等.溫針灸對骨關節炎大鼠軟骨組織Clock、Bmal1蛋白的影響[J].中國中西醫結合雜志，2019，39（10）：1225-1229.

[8]蔡國偉，李佳，李靜.溫針灸對類風濕性關節炎大鼠關節滑膜組織沉默信息調節因子2相關酶1和核轉錄因子-κB蛋白的影響[J].針刺研究，2017，42（5）：397-401.

[9]冉國平，劉嘉穎，楊大業，等.電針足三里對腸易激綜合征腹瀉型大鼠炎性損傷的機制研究[J].中國中西醫結合雜志，2019，39（3）：342-346.

[10] 劉金星.針刺對RA小鼠Th1/Th2相關細胞分子和Foxp3表達的研究[D].成都：成都中醫藥大學，2019.

[11]Schmidt CJ，Wenndorf K，Ebbers M，et al.Infection With Clostridioides difficile Attenuated Collagen-Induced Arthritis in Mice and Involved Mesenteric T（reg） and T（h2） Polarization[J].Front Immunol，2020，11：571049.

[12]周春瑜，陳艷林，付庭娜，等.中醫辨治類風濕關節炎的研究進展[J].風濕病與關節炎，2020，9（10）：72-75.

[13]周蘭，周巍，黎銘玉，等.基于數據挖掘探討電針治療類風濕關節炎的選穴用經規律[J/OL].海南醫學院學報：1-10[2021-12-31].DOI：10.13210/j.cnki.jhmu.20200910.001.

[14]楊繼洲.針灸大成[M].北京：人民衛生出版社，1984：23.

[15] 蔡國偉，彭銳，李佳，等.溫針灸對類風濕關節炎大鼠關節軟骨vimentin蛋白的影響[J].上海針灸雜志，2017，36（11）：1361-1366.

[16]Tache Y，Larauche M，Yuan PQ，et al.Brain and Gut CRF Signaling：Biological Actions and Role in the Gastrointestinal Tract[J].Curr Mol Pharmacol，2018，11（1）：51-71.

[17]包瑞玲，劉文濱，丁瑞峰，等.舒肝解郁膠囊聯合莫沙必利對功能性消化不良大鼠胃黏膜CRF、C-KIT表達的影響[J].中成藥，2021，43（2）：506-509.

[18]Jang JH，Lee DJ，Bae CH，et al.Changes in small intestinal motility and related hormones by acupuncture stimulation at Zusanli（ST 36） in mice[J].Chin J Integr Med，2017，23（3）：215-220.843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

[19]Mortier C，Govindarajan S，Venken K，et al.It Takes “Guts” to Cause Joint Inflammation：Role of Innate-Like T Cells[J].Front Immunol，2018，9：1489.

[20]Hvatum M，Kanerud L，Hllgren R，et al.The gut-joint axis：cross reactive food antibodies in rheumatoid arthritis[J].Gut，2006，55（9）：1240-1247.

[21]Zhang X，Zhang D，Jia H，et al.The oral and gut microbiomes are perturbed in rheumatoid arthritis and partly normalized after treatment[J].Nat Med，2015，21（8）：895-905.

[22]Jubair WK，Hendrickson JD，Severs EL，et al.Modulation of Inflammatory Arthritis in Mice by Gut Microbiota Through Mucosal Inflammation and Autoantibody Generation[J].Arthritis Rheumatol，2018，70（8）：1220-1233.

[23]Xu H，Zhao H，Fan D，et al.Interactions between Gut Microbiota and Immunomodulatory Cells in Rheumatoid Arthritis[J].Mediators Inflamm，2020，2020：1430605.

[24]皮珍平.類風濕性關節炎患者的關節外表現臨床分析[J].中國現代醫生，2009，47（30）：36-37.

[25]祝驥，梁宜，許穎齡，等.電針足三里和昆侖對佐劑性關節炎大鼠的治療作用[J].中國醫學物理學雜志，2012，29（5）：3694-3696，3701.

[26]劉邁蘭，周芝根，李波，等.針刺與艾灸治療功能性消化不良：隨機對照研究[J].中國針灸，2017，37（9）：943-946.

[27]覃穎，郭孟瑋，藍瑩，等.電針不同穴位對腸易激綜合征大鼠腸道動力和敏感性的影響[J].針刺研究，2020，45（4）：293-298.

（2021-04-09收稿本文編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（81774410）——基于軟骨細胞骨架蛋白探討溫針灸對骨關節炎的調節作用;湖北省衛健委項目（ZY2021M018）——溫針灸對骨關節炎大鼠微循環的調控作用作者簡介：談倩（1995.08—），女，碩士研究生在讀，研究方向：針灸治療骨關節病，E-mail：1298093978@qq.com通信作者：蔡國偉（1964.12—），男，碩士，主任醫師，副教授，研究方向：針灸治療骨關節病，E-mail：cgw645@163.com843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F