康萊特注射液對淋巴瘤Raji細胞的殺傷作用

李丹 趙百孝 王建勛 韓麗 胡凱文

摘要 目的：研究不同濃度康萊特注射液（KLT）對人伯基特淋巴瘤Raji細胞株的增殖抑制與凋亡作用，探討其防治惡性腫瘤的作用機制。方法：應用流式細胞術、CCK-8法等方法觀察12、24、48 h不同時間點KLT對Raji細胞生長的影響。結果：流式細胞術檢測發現，KLT濃度為1、10、50、100、200 μL/mL作用12 h可引起Raji細胞凋亡率-0.95%、50.93%、100%、44.39%、-9.94%;CCK-8檢測發現，KLT濃度為1、10、50 μL/mL作用12 h可引起Raji細胞生長抑制率為55.41%、25.15%、39.94%，100、200 μL/mL可促進細胞增殖率為122.62%、146.81%;KLT作用24 h后可引起Raji細胞生長抑制率為32.25%、26.24%、31.61%、129.49%、160.09%;KLT作用48 h后可引起Raji細胞生長抑制率為91.65%、81.47%、33.74%、103.75%、50.97%。結論：KLT對Raji細胞株的生長具有促進、抑制雙向調節作用，并與作用時間及濃度密切相關。

關鍵詞 康萊特注射液;Raji細胞;凋亡;流式細胞術;CCK-8法

Killing Effect of Kanglaite Injection on Lymphoma Raji Cells

LI Dan1，ZHAO Baixiao2，WANG Jianxun3，HAN Li2，HU Kaiwen4

（1 Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 3 School of Life Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 4 Department of Oncology，Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

AbstractObjective： To study the effects of different concentrations of Kanglaite Injection（KLT） on the proliferation and apoptosis of human Burkitt′s lymphoma Raji cells，and to explore the mechanism of KLT in preventing and treating malignant tumors. Methods： Flow cytometry and CCK-8 assay were employed to study the effects of KLT on the growth of Raji cells at the time points of 12，24，and 48 h. Results： The results of flow cytometry showed that the exposure to 1，10，50，100，and 200 μL/mL KLT for 12 h caused the apoptosis rates of -0.95%，50.93%，100%，44.39%，and -9.94%，respectively，in Raji cells.The CCK-8 assay demonstrated that 1，10，and 50 μL/mL KLT treatments for 12 h showed the inhibition rates of 55.41%，25.15%，and 39.94%，respectively，on Raji cells，while 100 μL/mL and 200 μL/mL KLT led to the cell proliferation rates of 122.62% and 146.81%，respectively.The 1，10，50，100，and 200 μL/mL KLT treatments for 24 h led to the inhibition rates of 32.25%，26.24%，31.61%，129.49%，and 160.09%，respectively.The treatments for 48 h caused the inhibition rates of 91.65%，81.47%，33.74%，103.75%，and 50.97%，respectively. Conclusion： KLT has dual regulatory effects on the growth of Raji cells，which is associated with the treatment time and KLT concentration.

Keywords Kanglaite Injection; Raji cells; Apoptosis，Flow cytometry; CCK-8

中圖分類號：R248;R285.5 文獻標識碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.016843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

非霍奇金淋巴瘤（Non Hodgkin Lymphoma，NHL）是全球最常見的血液系統惡性腫瘤，占癌癥診斷和死亡總人數近3%，男性患病風險高于女性，其發病率近年來逐漸提高[1-2]。化學治療是NHL的主要方法，引起的不良反應可增加患者生理和心理負擔，進而產生強烈應激反應，導致患者出現負性情緒，影響化療依從性[3]。其中醫病因病機涉及濕、痰、毒、瘀、虛，利濕、化痰、解毒、化瘀、扶正是淋巴瘤的重要治法。當代腫瘤名家王沛、黃振翹等總結歷代先賢相關論述并結合臨床實踐，將NHL歸為7大類證候：氣滯毒瘀型、寒痰凝滯型、虛火痰結型、血瘀痰積型、血熱風燥型、肝腎陰虛型、氣血兩虧型[4-5]。薏苡仁，其味甘，性微寒，歸脾、胃、肺經;《神農本草經》云：“主筋急，拘攣不可屈伸，風濕痹，下氣……”現代藥理研究證實，其中含有酯類、脂肪酸、多糖、甾體、三萜及蛋白質等化合物逾41種，具有調節機體免疫、降低血糖濃度及抑制腫瘤生長等作用[6]，是抗癌中藥康萊特注射液（KLT）的主要成分，臨床上并被廣泛應用于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌等實體瘤及白血病、淋巴瘤等血液腫瘤的治療[7]。

本研究通過流式細胞儀觀察不同濃度KLT干預Raji細胞12 h后的腫瘤細胞凋亡率;CCK-8法觀察12 h、24 h、48 h時KLT對Raji細胞生長情況的影響，立足于為臨床提供KLT治療NHL最適劑量的實驗室依據，并進一步豐富KLT治療NHL學術內涵。

1材料與方法

1.1細胞

血液瘤Raji細胞株（中國醫學科學院基礎醫學研究所，貨號：3101HUMTCHu44）。

1.2藥物與試劑

康萊特注射液（浙江康萊特藥業有限公司，國藥準字Z10970091）執行標準：WS3-301（Z-038）-2001（Z），均在常溫干燥處保存。RPMI1640培養基（Gibco，批號：1517016），FBS（Biological Industries，批號：1715752），青-鏈霉素（Caisson Labs，批號：PSL01），CCK-8（北京北仁化學，批號：20150221）。

1.3主要儀器

離心機（Eppendorf，德國，型號：5417R），超凈工作臺（哈爾濱市東聯，型號：FLC-3），倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：CKX41），二氧化碳培養箱（SANYO，日本，型號：MC0175），流式細胞儀（江蘇貝克曼庫爾特，型號：A00-1-1102），熒光/吸收光酶標儀（BioTek，美國，型號：ELx800）。

1.4實驗方法

1.4.1Raji細胞培養

Raji細胞（購買于中國醫學科學院基礎醫學研究所）以1×106個/mL接種于含新鮮的RPMI1640培養液（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及10%胎牛血清）中培養于37 ℃、5%CO2的培養箱內，待細胞系處于對數生長期加入不同濃度KLT進行加藥處理。

1.4.2細胞形態觀察及流式細胞儀測定

以1、10、50、100、200 μL/mL的KLT處理5×105個處于對數生長期的Raji細胞12 h，倒置顯微鏡觀察細胞狀態，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）清洗細胞，用45 μL染色緩沖液重懸細胞，每孔加入相應熒光標記抗體5 μL;4 ℃或者室溫避光孵育30 min至1 h，可在搖床上慢搖加速染色，每孔加入PBS清洗，用40 μm濾網過濾細胞，進行流式檢測。數據經CellQuest軟件進行分析（Becton Dickinson，San Jose，CA，美國）。

1.4.3實驗分組及CCK-8法觀察各組細胞生長情況

實驗分為空白對照組和1、10、50、100、200 μL/mL不同濃度梯度KLT觀察組。收集對數生長期Raji細胞，設置各濃度細胞培養基及調整細胞懸液濃度至2×105個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，各設5個復孔，邊緣孔用0.01 mol/L無菌PBS填充，于37 ℃，5%CO2培養箱里分別培養12 h、24 h、48 h后，在避光條件下統一加入含10%CCK-8無血清培養基100 μL，37 ℃，5%CO2條件下繼續培養2 h，于酶標儀450 nm波長處檢測并記錄光密度（Optical Density，OD）值，計算各觀察組增殖率。

增殖率（%）=（給藥組-空白組）OD值/空白組OD值×100%。

1.5統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，滿足正態分布且方差齊的計量資料以均數±標準差（ ?±s ）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，以 P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1KLT對Raji細胞凋亡的影響

位于左下象限（Annexin V-PI-）提示為活細胞，分布于左上象限（Annexin V-PI+）的為損死或壞傷的細胞，位于右下象限（Annexin V+PI-）的細胞提示有早期凋亡，分布于位于右上象限（Annexin V+PI+）則為晚期凋亡的細胞。

12 h后1、10和50、100、200 μL/mL與空白對照組KLT處理后的Raji細胞早期凋亡率分別為（8.67±2.00）%、（13.22±2.28）%、（17.51±1.20）%、（11.98±2.82）%、（7.89±2.50）%、（8.27±2.51）%。與空白對照組比較，10 μL Raji細胞的早期凋亡率增加（ P <0.05），50 μL Raji細胞的早期凋亡率明顯上升（ P <0.01）。見圖1～2。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

2.2KLT對Raji細胞增殖的影響

與空白對照組比較，12、24、48 h的1 μL、10 μL、50 μL組Raji細胞數量顯著減少（均 P <0.01），100 μL、200 μL組的Raji細胞數量明顯增加;12、24 h后，與50 μL組比較，空白對照組Raji細胞數量顯著減少（均 P <0.01），100 μL、200 μL組Raji細胞數量明顯增加（均 P <0.01）;48 h后，與50 μL組比較，1 μL、10 μL組與空白對照組Raji細胞數量顯著減少（均 P <0.01），100 μL、200 μL組Raji細胞數量明顯增加（均 P <0.01）。見表1。

2.3KLT對Raji細胞增殖率的影響

與空白對照組比較，12、24、48 h的1 μL、10 μL、50 μL組的Raji細胞增值率為負值，100 μL、200 μL組的Raji細胞增殖率為正值，康萊特在1 μL、10 μL、50 μL濃度內對Raji細胞具有抑制作用，100 μL、200 μL濃度對Raji細胞增殖具有促進作用，其中，1 μL組的抑制作用與100 μL組的促進作用最顯著。見表2。

3討論

前期研究表明，KLT聯合化療藥物治療腫瘤，具有顯著“增效減毒”效應。姚小健[8]將49例老年胃癌隨機分為2組，對照組22例接受替吉奧聯合奧沙利鉑化療，觀察組27例在對照組的基礎上給予KLT，結果對照組有效率為36.4%，疾病控制率為45.5%，遠低于觀察組的66.7%、77.8%，差異有統計學意義（ P <0.05）。2組主要不良反應均為Ⅰ、Ⅱ度的胃腸道反應、肝功能損傷、腎功能損傷、神經毒性及骨髓抑制，發生率比較差異無統計學意義（ P >0.05）。對照組生命質量改善率為36.4%，體質量改善率27.3%，遠低于觀察組的66.7%、59.3%，且差異有統計學意義（均 P <0.05）。對于肺部惡性腫瘤轉移腦部患者，譚寶利[9]在旋轉式伽馬刀及立體定向全腦放療聯合KLT治療中，單純放療組的無進展生存期（Progression Free Survival，PFS）為10.9個月，而聯合組的PFS為11.9個月。KLT能減輕晚期鼻咽癌患者放療的不良反應，提高患者的生命質量。張苗苗[10]收集明確臨床診斷為轉移或進展期為Ⅲ、Ⅳ期的非小細胞肺癌患者，隨機分為對照組和觀察組，每組50例。觀察組接受KLT聯合吉西他濱及順鉑化療治療，對照組接受吉西他濱及順鉑化療治療，結果觀察組的聯合治療提高了化療療效，并增加了化療患者對疾病的抵抗力，延長了癌癥患者的壽命。楊曉玲[11]對41例晚期惡性腫瘤患者應用KLT治療前后的研究發現，KLT治療后患者體力狀況、進食量及體質量均較治療前明顯改善;血清白蛋白、前清蛋白及血紅蛋白等指標較前升高（均 P <0.05）;T細胞亞群CD3、CD4及自然殺傷細胞比例較治療前提高，差異有統計學意義。

魏衛等[12]在相關研究中補充了KLT可以顯著改善腫瘤患者胃腸道功能，正如《本草經疏》所云“性燥能除濕，味甘能入脾補脾……利腸胃，消水腫令人能食”。謝和平等[13]將64例中晚期原發性肝癌患者隨機分為觀察組和對照組。對照組單純接受TACE治療，觀察組在TACE治療的基礎上聯合使用KLT。結果治療后，對照組的改善程度及上升例數，卡諾夫斯凱計分評分數值方面均差于觀察組（均 P <0.05）。觀察組完全緩解1例，部分緩解15例，總有效率50.0%;對照組完全緩解0例，部分緩解8例，總有效率25.0%，觀察組總有效率顯著優于對照組（ P <0.05）。黃挺等[14]為了觀察KLT與肝動脈結扎法對大鼠荷瘤脾重與肝癌轉移灶的抑制作用，通過接種W256癌肉瘤建立Wistar大鼠肝癌轉移模型，發現KLT可顯著抑制原發灶生長與肝癌轉移灶形成，抑制基質金屬蛋白酶-1表達是其抗肝轉移的重要機制。實體腫瘤生長、浸潤和轉移必須有腫瘤血管形成，其中，血管內皮生長因子（VEGF）作為血管形成因子起重大的作用。 莫安薇等[15]收集非小細胞肺癌（NSCLC）伴發惡性胸腔積液患者108例作為研究對象，隨機分為對照組和觀察組，每組54例。對照組胸腔注射注射用洛鉑，30 mg/m2溶于5%葡萄糖注射液50 mL。觀察組在對照組基礎上胸腔注射KLT，100 mL/次，1次/d。治療后發現，2組患者胸水中VEGF和RCAS1（Receptor-binding Cancer Antigen Expressed on SiSo Cells， 一種表達于SiSo細胞受體結合腫瘤抗原）表達均顯著減低（均 P <0.01），且觀察組胸水中VEGF和RCAS1表達顯著低于對照組（均 P <0.05）。

前期研究證實，中醫藥聯合化療等治療方式可很大程度改善NHL患者的預后。王孟琦等[16]對336例隨訪期NHL患者的中醫證型分布、中醫癥狀特點及證型與臨床檢驗指標的相關性進行了研究，發現預后可能較好的是脾虛濕盛證的患者，而痰瘀互結證、陰虛證、痰濕凝滯證及痰熱內蘊證的患者，其預后可能相對較差。劉凱等[17]將符合納入標準的31例NHL患者隨機分為觀察組15例和對照組16例。對照組采用CHOP方案化療，觀察組在對照組的基礎上聯合六味地黃丸治療，觀察比較2組療效。2組總有效率差異無統計學意義（ P >0.05），但Ⅱ/Ⅲ度胃腸道反應發生率觀察組為31.2%，低于對照組的46.7%（ P <0.05）;骨髓抑制發生率觀察組低于對照組（ P <0.05）; 對照組肝腎毒性發生率為26.7%，觀察組為12.5%，對照組明顯高于觀察組（ P <0.05）;治觀察組患者在潮熱盜汗、腰膝酸軟、消瘦等改善明顯優于對照組（ P <0.05）。陳四明等[18]選取陰虛火旺型NHL患者58例，將其隨機分為觀察組和對照組，每組29例。對照組接受CHOP化療方案治療，觀察組在對照組的治療方案上給予穴位敷貼聯合牛角地黃湯治療，試驗結果提示觀察組能夠顯著減少陰虛火旺型NHL患者化療后的不良反應發生，并提高實體瘤的臨床療效。陳方等[19]將B細胞NHL患者隨機分為30例對照組及32例觀察組，對照組給予單純化療治療，觀察組聯合扶正散結湯，觀察2組患者治療結束后的治療效果、不良反應及PFS。發現扶正散結湯聯合化療治療B細胞NHL可明顯減輕化療不良反應及延長患者PFS。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

另外，除實體瘤外，KLT還被廣泛應用于白血病、淋巴瘤等血液腫瘤的治療中，但相關的機制研究還較少。前期研究中，董慶華等[20]觀察KLT對耐藥人白血病細胞K562/adr及K562/vcr的作用研究中，發現KLT能逆轉多藥耐藥人白血病細胞株的耐藥性，并能誘導其凋亡。有研究應用細胞生長曲線、電鏡及流式細胞儀等觀察了KLT對Raji細胞生長情況的影響，發現小劑量KLT即可使Raji細胞凋亡[21-22]。本研究中獲取的實驗結果示，KLT中小劑量對Raji細胞的抑制效果最佳，劑量過高并不能增加其對Raji細胞的殺傷作用，相反，高濃度KLT對Raji細胞的增殖具有促進作用。這一實驗結果，也更好地揭示了中醫藥的雙向調節作用，并為臨床選取最優劑量提供了實驗室依據。我們在實驗過程中發現，KLT本身的濃度梯度會對OD值產生影響，二者正相關。該實驗結果表明，KLT對Raji細胞株的生長具有促進、抑制的雙向調節作用，并與作用時間及濃度密切相關。

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（2021-05-09收稿本文編輯：楊覺雄）

基金項目：國家重點研發計劃項目（2019YFC1711904）;教育部雙一流引導專項師資隊伍建設項目（1000061020014）作者簡介：李丹（1991.08—），女，博士研究生在讀，研究方向：中西醫結合防治惡性腫瘤，E-mail：20190941214@bucm.edu.cn通信作者：胡凱文（1964.08—），男，博士，主任醫師，教授，研究方向：中西醫結合防治惡性腫瘤，E-mail：drkaiwenhu@163.com843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F