血管生成素1在高同型半胱氨酸血癥大鼠血漿中高表達及對內皮細胞的保護作用

沈童童，周利民，董雙雙，王欣欣，徐小紅，劉 玉，鄭 凡，馬劭博，沈 兵

血管生成素1(angiopoietin 1, Ang 1)由血管壁細胞、周細胞和某些其他細胞生成，主要表達于血管內皮細胞，并與其特異性受體型酪氨酸激酶Tie-2的配體結合[1-2]。Ang 1具有促進血管內皮細胞遷移、增殖、侵襲和防止滲漏等作用[3-4]。但其在高同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)血癥引起的血管內皮功能損傷修復中的作用未見報道。

Hcy異常升高被廣泛認為是心血管疾病的獨立危險因素之一。過多的Hcy會導致血管內皮功能損傷，引起血管的新生、收縮、通透性等功能改變，其分子機制復雜[5]。該研究探討高Hcy飼料喂養的SD大鼠血漿中Ang 1變化及其對血管內皮細胞遷移和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器 Ang 1(貨號：13667-H02H1)購自北京義翹神州生物技術有限公司；Ⅰ型膠原蛋白酶(貨號：SCR103)、Hcy(貨號：H4628)購自德國Merck公司；CCK-8試劑(貨號：A311-01)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司公司；Label-free質譜儀Orbitrap Fusion、液相色譜Easy nLC/Ultimate 3000購自美國Thermo Scientific公司；倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)；SpectraMax M5讀板儀(美國Molecular Devices公司)。

1.1.2實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠，體質量200～220 g，安徽醫科大學動物中心提供。自由進食進水，飼養室溫維持(22±1)℃。

1.2 方法

1.2.1高Hcy血癥動物模型 對照組和實驗組各4只SD大鼠，對照組大鼠采用anAIN93M基礎飼料喂養，高Hcy血癥模型組采用同樣基礎飼料，但不含葉酸、維生素B12和維生素B6。兩種飼料都含有1%的磺胺噻唑，可以抑制腸道細菌形成葉酸。5周后成模，CO2窒息處死后迅速進行心臟穿刺取血，采用化學發光法測定血清Hcy水平。

1.2.2Label-free蛋白質譜分析 將大鼠血漿去除中高豐度蛋白后，低豐度蛋白濃縮凍干，復溶后測濃度，取60 μg蛋白溶解后加入胰蛋白酶37 ℃降解16 h，樣品經過毛細管高效液相色譜分離后進行質譜儀分析，后續再予以Label-free分析獲得蛋白質信息。

1.2.3腸系膜動脈內皮細胞原代培養 將健康雄性SD大鼠CO2窒息處死，用剪刀解剖大鼠腹部，一次性針筒插入左心室，用無菌生理緩沖液灌流直至肝臟變白，剝離其腸系膜動脈血管，分離多余的脂肪組織，將腸系膜動脈血管剪碎，用Ⅰ型膠原蛋白酶消化(37 ℃，10 min)，離心后棄上清液，加入1 ml培養基，吹打混勻，移至培養皿中，1 h后換液。

1.2.4細胞劃痕實驗 用Marker筆在6孔板背后沿著直尺大約每隔0.5 cm劃一道線，橫穿過孔(每孔5～6條線)，每孔加入約5×105個細胞，37 ℃培養箱過夜培養，第2天用200 μl槍頭沿著直尺與標記線垂直的方向劃兩條平行線，用無菌PBS洗去劃掉的細胞，加入培養基放入培養箱(37 ℃、5% CO2)，按0、24 h用倒置顯微鏡觀察，拍照。

1.2.5CCK-8細胞增殖實驗 首先在無血清的培養基中同步化細胞，繼而在96孔板中配制100 μl/孔的細胞懸液，將培養板在培養箱中預培養24 h(37 ℃、5% CO2)。棄除培養基，向培養板加入100 μl/孔不同濃度的Hcy標準品，在培養箱孵育24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，在培養箱中孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。

2 結果

2.1 高Hcy血癥大鼠血漿蛋白改變蛋白質譜實驗共檢測到對照組和高Hcy血癥組大鼠血漿中555個蛋白，其中5個蛋白(Mmrn1、Tgfb1、Ctsa、Ang 1、Golgb1)在血漿中的表達量上調，17個蛋白(RGD1565617、Psmb1、Psma6、Jchain、Tfrc、Lamp2、Igh-6、LOC103690319、Sell、Cd5l及7個未知蛋白)表達量下調(圖1A)；將兩組出現差異表達的蛋白進行聚類分析，兩組樣本具有較一致的變化趨勢(圖1B)。

圖1 蛋白質譜火山圖和熱點圖A：蛋白質譜火山圖；紅色點：上調的蛋白；綠色點：下調的蛋白；黑色點：無顯著性差異的蛋白；B：蛋白質譜熱點圖；1～4：實驗組；5～8：對照組；紅色：上調；綠色：下調

2.2 高Hcy血癥大鼠血漿Ang 1蛋白濃度表達變化高Hcy血癥大鼠血漿Hcy濃度比對照組升高[(3.72±0.43 )μmol/Lvs(36.82±6.22 ) μmol/L,n=4,t=-5.309,P<0.05]。在蛋白質譜檢測結果中，對照組和高Hcy血癥組大鼠血漿Ang 1蛋白含量差異如圖2所示，與對照組相比，實驗組大鼠血漿中Ang 1蛋白含量升高(t=-3.748,P<0.05)。

圖2 大鼠血漿Ang 1蛋白表達水平A：兩組大鼠血漿Ang 1蛋白質譜結果熱點圖：1～4：實驗組；5～8：對照組；B：變化倍數統計數據；與對照組相比較：*P<0.05

2.3 Ang 1對Hcy抑制的大鼠腸系膜動脈內皮細胞遷移的影響Ang 1(600 ng/ml)處理內皮細胞24 h后，與對照組相比，血管內皮細胞劃痕后的愈合率增強[(21.76%±1.71%)vs(33.18%±3.61%),n=8,t=-2.859,P<0.05](圖3A)；另一組采用0、10、30、50 μmol/L的Hcy處理內皮細胞24 h，結果顯示30、50 μmol/L的Hcy處理組劃痕后的愈合率受到抑制(圖3B、C)；第三組采用0 μmol/L Hcy+溶劑對照、30 μmol/L Hcy、30 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)、50 μmol/L Hcy、50 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)分別處理內皮細胞24 h，結果顯示Ang 1阻斷了30 μmol/L Hcy引起的劃痕后愈合抑制效應，但Ang 1沒有阻斷50 μmol/L Hcy引起的劃痕后愈合抑制效應(圖3D)。

圖3 Ang 1對Hcy抑制的腸系膜動脈內皮細胞遷移的阻斷作用A：Ang 1對腸系膜動脈內皮細胞遷移的影響(n=8)；與對照組比較：△P<0.05；B、C：不同濃度Hcy對腸系膜動脈內皮細胞遷移的影響(n=8)；與0 μmol/L Hcy組比較：▽P<0.05；D：Ang 1對不同濃度Hcy抑制的腸系膜動脈內皮細胞遷移的阻斷作用(n=8)；與0 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：*P<0.05；與30 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：#P<0.05

2.4 Ang 1對Hcy抑制的大鼠腸系膜動脈內皮細胞增殖作用的影響實驗以腸系膜動脈內皮細胞為研究對象，結果顯示，0、10、30、50 μmol/L的Hcy處理內皮細胞24 h后，30、50 μmol/L的Hcy抑制了內皮細胞增殖(圖4A)；另一組采用0 μmol/L Hcy+溶劑對照、30 μmol/L Hcy、30 μmol/L Hcy+ Ang 1(600 ng/ml)、50 μmol/L Hcy、50 μmol/L Hcy+Ang 1(600 ng/ml)分別處理內皮細胞24 h，結果顯示，Ang 1阻斷了30 μmol/L Hcy引起的增殖抑制效應，但對50 μmol/L Hcy抑制的增殖無阻斷作用(圖4B)。

圖4 Ang 1對Hcy抑制的腸系膜動脈內皮細胞增殖的阻斷作用A：不同濃度Hcy對腸系膜動脈內皮細胞增殖的影響(n=3)；與0 μmol/L Hcy組比較：&P<0.05；B：Ang 1對不同濃度Hcy抑制的腸系膜動脈內皮細胞增殖的阻斷作用(n=6)，與0 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：*P<0.05；與30 μmol/L Hcy+0 ng/ml Ang 1組比較：#P<0.05

3 討論

美國心臟協會在2014年將Hcy血漿水平>10 μmol/L作為高Hcy血癥的臨床診斷標準[5]。2018年修訂版的《中國高血壓防治指南》中將血漿中Hcy水平修訂為≥15 μmol/L作為診斷高Hcy血癥的臨床標準[6]。血漿中過高的Hcy可引起血管內皮功能損傷，參與動脈粥樣硬化的發生發展，從而引起一系列心腦血管疾病[7-9]，因此，闡明高Hcy血癥在高血壓及各種心腦血管疾病發生發展中的作用具有重要意義。

研究[10]顯示，Hcy可通過增加細胞內的活性氧引起線粒體途徑的凋亡，參與心腦血管疾病的發生發展。抗氧化劑可緩解Hcy引起氧化應激并激活VEGF-VEGFR-FAK信號通路導致的內皮功能損傷[11]。也有研究[12]報道補充Hcy代謝調節中的葉酸可抑制Hcy引起的臍靜脈內皮細胞凋亡。在Hcy對血管生成素影響方面，僅有文獻報道Hcy處理可顯著抑制臍靜脈內皮細胞的Ang 1和2的表達[13]，但血管生成素對高Hcy引起的內皮功能損傷的抑制作用國內外文獻未見報道。因此，闡述血管生成素對高Hcy引起的內皮功能損傷的調節作用具有重要的理論意義和應用價值。蛋白質譜檢測方法可以從一個樣本中同時鑒定多種蛋白質類型及其表達水平，是蛋白組學研究的重要手段[14]，本研究采用蛋白質譜方法從動物水平研究顯示，高Hcy血癥大鼠血漿蛋白表達譜出現改變，多個蛋白出現上調或下調，其中Ang 1在高Hcy血癥大鼠血漿中也上調。而Ang 1具有促進血管內皮細胞遷移、增殖、侵襲和防止滲漏等內皮保護作用，因此猜測，在高Hcy血癥大鼠中，Ang 1可能為反射性的升高，從而阻斷高Hcy引起的內皮功能損傷，是一種內皮保護性的代償機制。為證實該推測，本實驗以與血壓形成密切相關的阻力血管，即腸系膜上動脈為研究對象，通過原代培養腸系膜上動脈內皮細胞并進行實驗驗證。結果顯示，Hcy可濃度依賴地抑制內皮細胞遷移和增殖，說明一定濃度的Hcy可引起內皮細胞功能損傷。但是，當一定濃度的Ang 1與Hcy共同處理內皮細胞時，阻斷了低濃度Hcy抑制的內皮細胞遷移和增殖，但不能阻斷高濃度Hcy引起的內皮損傷。說明Ang 1只能在一定范圍內對Hcy引起的內皮損傷有修復作用。本研究中的高Hcy血癥大鼠血漿中，Hcy濃度為36.82 μmol/L左右，與本研究細胞實驗中Ang 1有效阻斷Hcy引起內皮功能損傷的Hcy濃度接近，說明Ang 1在高鹽飲食情況下會起到一定的血管內皮功能保護作用。因此，高Hcy血癥一方面可引起血管內皮損傷，另一方面可引起細胞合成和分泌蛋白增強或減弱。其中，高Hcy反射性引起Ang 1在血漿中含量升高，而升高的Ang 1可在一定程度上阻斷了高Hcy引起的內皮功能損傷，可能參與高Hcy血癥時內皮功能的代償機制。另一方面，該結果也提示Ang 1在Hcy血癥引起的血管內皮功能損傷中也具有潛在治療價值。但本研究仍未闡明，在高Hcy血癥大鼠血漿中升高的Ang 1通過何種細胞內信號通路抑制Hcy引起的血管內皮細胞損傷以及Ang 1來自于何種組織細胞。

綜上所述，高Hcy血癥可顯著影響部分血漿蛋白分泌，且高Hcy血癥模型大鼠血漿中升高的Ang 1可在一定濃度范圍內參與阻斷高Hcy引起的血管內皮功能損傷。該研究揭示了一種高Hcy血癥血管內皮功能代償機制，也為Ang 1在Hcy血癥引起的血管內皮功能損傷治療中提供潛在的新方法和新靶點。