不同Sap活性白假絲酵母菌對陰道上皮局部免疫的影響

邵明琨，侯夢瑤，羅丹丹，祁文瑾

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的下生殖道感染性疾病。復發性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)是指1年內有癥狀并經實驗室檢查證實的VVC發作4次或以上[1]。據全球調查，75%婦女一生中至少患過1次VVC，40%～50%的女性會反復感染，5%～8%的女性會患RVVC[2]。其中，致病菌的菌種、基因型、耐藥性、分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartate protease，Sap)和磷酯酶(phospholipase，Plb)在侵襲機制中起著重要作用[3]。陰道局部的Th細胞及其炎癥免疫因子也參與了疾病的發生發展[4]。

目前尚無研究對VVC和RVVC致病菌株侵襲力進行分析。該研究比較了VVC和RVVC致病菌株侵襲力的差異性；選取Sap活性有差異的白假絲酵母菌和人陰道上皮細胞共培養,分析陰道上皮分泌細胞因子的情況；為VVC和RVVC的發病機制研究及臨床防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料所有致病白假絲酵母菌均來自昆明醫科大學第一附屬醫院婦產科門診VVC、RVVC患者，收集時間為2018年9月—2019年3月。VVC、RVVC診斷標準以《婦產科學》(人民衛生出版社，第九版)為依據。排除：妊娠期、哺乳期、患糖尿病、口服避孕藥、3個月內接受過全身抗真菌治療或1個月內接受過外用抗真菌藥物治療、患免疫性疾病或正在服用免疫抑制劑、混合陰道感染者。人陰道上皮組織取自在昆明醫科大學第一附屬醫院因“子宮肌瘤或子宮腺肌癥”行子宮全切術的患者，取切下的陰道組織約1 cm×1 cm進行實驗。實驗取得患者知情同意、通過醫院倫理委員會批準。

沙堡羅氯霉素培養基(法國梅里埃公司)；念珠菌顯色平板(上海安圖生物公司)；角化細胞無血清培養基(K-SFM，美國Gibco公司)；中性蛋白酶(DispaseⅡ，美國Sigma公司)；無菌脫脂奶粉(上海生工公司)；50%卵黃乳液(青島海博生物公司)；人白細胞介素(interleukin，IL)-4、 IL-8、IL-17 ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技公司)；酵母基因組DNA提取試劑盒(Yeast DNA Kit，離心柱型，北京天根科技公司)；PCR Mix(北京天根科技公司)；氟康唑(fluconazole，FLU)標準粉、兩性霉素(amphotericin，AMB)標準粉、伊曲康唑(itraconazole，ITR)標準粉(北京中國食品藥品檢定研究所)；Alamar Blue(英國Bio-rad有限公司)

1.2 假絲酵母菌純化、菌種鑒定假絲酵母菌純化：用無菌棉拭子將VVC/RVVC患者陰道分泌物接種到沙堡羅培養皿上，再用四區劃線法分離單菌落。菌種鑒定：嚴格按照安圖念珠菌顯色平板說明書進行鑒定。選取白假絲酵母菌進行下列實驗。

1.3 白假絲酵母菌的基因分型、藥敏實驗及Sap、Plb活性檢測使用25S rDNA-PCR法對白假絲酵母菌進行基因分型[5]。標準株為白假絲酵母菌ATCC90028，購自美國細胞典藏中心。

參照CLSI推薦的M27-A3方案中適用于酵母菌的微量稀釋法,對白假絲酵母菌進行FLU、ITR、AMB的體外藥敏實驗。使用Alamar Blue顯色劑來幫助判讀結果。Alamar Blue保持藍色表示真菌生長受抑制,變為紅色表示真菌生長無抑制。根據CLSI建立的M27-A3中的MIC折點值,將所有菌株分為敏感、非敏感菌株。

用牛奶培養基和蛋黃培養基對鑒定出的白假絲酵母菌行Sap、Plb活性測定。以PA值表示Sap活性，PA =菌落直徑/總直徑(菌落直徑+透明圈)。用PZ值表示Plb活性，PZ=菌落直徑/總直徑(菌落直徑+沉淀圈)。PA或PZ值愈低，菌株的天冬氨酰蛋白酶或Plb的活性愈強[6]。

1.4 人陰道上皮細胞分離培養及鑒定人陰道上皮組織來自昆明醫科大學第一附屬醫院婦產科，置于40 ml HANK′S液(3%雙抗)，低溫轉運。組織用含3%雙抗的0.9%氯化鈉溶液洗滌3次(每次10 ml，1 000 r/min離心3 min)，無菌條件下在10 cm皿中剔除壞死組織,于DispaseⅡ中4 ℃過夜消化，第2天將分離出的陰道上皮組織在含15%FBS的DMEM高糖培養基中剪碎，PBS洗滌2次。加入兩倍體積的胰酶，37 ℃消化3 min，吸取消化液，用等體積的含血清的培養基中和，混勻消化后的細胞用70 μm的濾膜過濾，PBS洗滌2次。細胞用K-SFM培養基培養。

人陰道上皮細胞培養至第2代，將細胞培養于6孔板中待細胞培養至70%，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定細胞，按照角蛋白質(廣譜)抗體試劑說明書進行細胞鑒定：采用免疫化學染色SP法，一抗為角蛋白質(廣譜)抗體，按照1 ∶100稀釋，二抗采用通用二抗進行孵育，采用DAB進行顯色，蘇木精復染后封片，顯微鏡200倍下觀察并計數陽性細胞數。

1.5 陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養后細胞因子測定按1×106個/ml濃度將細胞接種于25 cm2細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱培養。當貼壁細胞數達70%～80%時進行傳代，第3代細胞貼壁數目達70%～80%時進行共培養實驗。從VVC致病白假絲酵母菌中選取Sap活性最弱(Sap弱組)和最強(Sap強組)的菌株各4株，Sap強組Sap活性(PA值)分別為0.247 9、0.242 2、0.272 9和0.278 7，Sap弱組Sap活性(PA值)分別為0.731 4、0.688 3、0.665 5和0.597 4，分別用K-SFM培養液配置菌液濃度為1×106CFU/ml。實驗實驗以不加白假絲酵母菌的人陰道上皮細胞為對照組。分別在共培養后6、12、24、48 h收取上清液，使用ELISA方法測定IL-4、IL-8、IL-17表達量。

2 結果

2.1 假絲酵母菌純化、菌種鑒定結果收集VVC菌株100株，RVVC菌株92株。VVC菌株中，白假絲酵母菌有95株，非白假絲酵母菌5株。RVVC菌株中，白假絲酵母菌有86株，非白假絲酵母菌有6株。無論VVC還是RVVC組，白假絲酵母菌所占比例均最高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 白假絲酵母菌基因分型、藥敏實驗及Sap、Plb活性結果基因分型：實驗對95株VVC白假絲酵母菌株及86株RVVC白假絲酵母菌株進行基因分型，根據條帶位置及數量可將致病白假絲酵母菌分為A、B、C 3型：僅有450 bp片段者為A型，僅有840 bp片段者為B型，兩條片段均有為C型(圖1A)。研究提示，A基因型在VVC和RVVC菌株中所占比例都最高，且VVC致病菌株及RVVC致病菌株的基因型分布無統計學差異(表1)。

藥敏實驗：比較VVC和RVVC兩組白假絲酵母菌的48 h FLU、AMB及ITB藥敏性，分析敏感、非敏感菌株比例后顯示：FLU、AMB及ITB敏感菌株在VVC組和RVVC組中所占比例無統計學差異(圖1D和表1)。

Sap活性及Plb活性檢測：對VVC及RVVC白假絲酵母菌株進行Sap、Plb活性測定(圖1B、C)。VVC組菌株的Sap活性高于RVVC組(P<0.05)，但兩組菌株的Plb酶活性無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖1 白假絲酵母菌基因分型、藥敏實驗及Sap、Plb活性A：白假絲酵母菌基因分型結果；B：牛奶培養基中檢測Sap活性；黑圈：真菌生長區域；紅色外圈：Sap酶活性陽性區域；C：蛋黃培養基中檢測Plb活性；黑圈：真菌生長區域；紅色外圈：Plb活性陽性區域；D：體外藥敏實驗結果；陰性對照：全部保持藍色不變；陽性對照：全部變為紅色

表1 VVC與RVVC菌株基因型、藥敏及Sap、Plb活性差異(株，n)

2.3 陰道上皮細胞培養人陰道上皮細胞在分離后的第0～3代都呈鋪路石樣生長，形態為多角形，輪廓清晰，折光性好。使用細胞角蛋白(廣譜)抗體(免疫組化)試劑盒檢測第2代陰道上皮細胞，陰道上皮細胞陽性比率為100%。見圖2。

圖2 光學顯微鏡觀察細胞形態及免疫組化染色 ×200A1～A4：人陰道上皮細胞分離后第0～3代；B：人陰道上皮細胞免疫組化鑒定

2.4 細胞因子檢測結果陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養后細胞上清液采用ELISA方法檢測IL-4、IL-8、IL-17。人陰道上皮細胞能分泌IL-4、IL-8、IL-17。感染白假絲酵母菌后，陰道上皮細胞能分泌更多的IL-4,且在感染第12小時達到峰值，而后逐漸降低。相比Sap弱組，Sap強組陰道上皮細胞IL-4的表達量在感染6、12 h更高(P<0.05)(表2)。感染白假絲酵母菌后，陰道上皮細胞能分泌更高的IL-8，且在感染第6小時就達到峰值，而后保持相同水平。相比Sap弱組，Sap強組的分泌量更多(P<0.05)(表3)。陰道上皮細胞在感染白假絲酵母菌后分泌的IL-17也更高。兩個實驗組的IL-17在感染第6小時就達峰值，而后逐漸降低。相比Sap弱組，Sap強組IL-17的分泌量更高(P<0.05)(表4)。

表2 ELISA檢測細胞上清液中IL-4分泌的情況

表3 ELISA檢測細胞上清液中IL-8分泌的情況

表4 ELISA檢測細胞上清液中IL-17分泌的情況

3 討論

VVC和RVVC的發病機制包括菌株的侵襲性和局部宿主免疫兩個方面。白假絲酵母菌是VVC或者RVVC中主要的致病菌[7]，通過表達多種毒力因子幫助其入侵以及在宿主體內定植，包括形態變化(酵母相-菌絲相的轉變)、表型轉換(白菌-灰菌的轉換)、耐藥性、基因型及分泌型毒力因子等[8]。本研究比較了VVC和RVVC致病菌株侵襲力的差異性，結果顯示，除外Sap活性，VVC和RVVC致病菌的菌種、25S rDNA-PCR基因分型、Plb活性、藥物敏感性均無差異。癥狀重、難治療的RVVC致病菌株的Sap活性反而比VVC致病菌株的更低。這些結果提示，相較于白假絲酵母菌的侵襲力，陰道宿主的免疫反應可能才是VVC、RVVC發生的主要因素。這與Jabra-Rizk et al[9]的研究近似：白假絲酵母菌侵襲宿主后，疾病的傳播主要由宿主免疫系統介導。本研究中RVVC致病菌株Sap弱的原因估計也跟宿主免疫反應有關。

Sap具有較高的蛋白水解酶活性，能降解黏膜表面的各種保護分子，為白假絲酵母菌的生長提供營養，增強黏附和侵襲能力；它還可以切斷宿主的天然免疫應答因子，在白假絲酵母菌的免疫逃逸中發揮重要作用[10]。此外，Sap還能在體內誘導宿主產生相應的細胞因子，如IL-1β和IL-18，而IL-1β激活的CD4T細胞能在VVC和RVVC發病機制中起重要作用[11]。本實驗探討了人陰道上皮細胞分泌IL-4、IL-8、IL-17的情況。IL-4是Th2細胞的代表性細胞因子，其主要作用是誘發過敏反應，增加對感染的易感性[12]。Th1細胞能激活巨噬細胞和中性粒細胞，增強吞噬和殺菌，起到免疫保護作用。近年來，Th1的保護作用逐步被Th17取代[13]。IL-17作為Th17細胞的主要效應因子，能動員感染部位的中性粒細胞，維持黏膜上皮的完整性，促進抗菌肽β-防御素的釋放，預防白念珠菌感染[14]。中性粒細胞對于宿主抵御侵襲性真菌疾病至關重要。IL-8是中性粒細胞趨化因子，本研究中以IL-8反映中性粒細胞的募集情況。

本研究顯示，人陰道上皮細胞具有分泌IL-4、IL-8、IL-17的能力，在受到白假絲酵母菌感染后，陰道上皮分泌的IL-4、IL-8、IL-17明顯升高。無論Sap強組還是Sap弱組，3種細胞因子的含量在感染早期就達到高峰，保護性因子IL-8和IL-17分泌的時間則更早，在感染后第6小時就達到高峰。隨著感染時間延長，IL-4和IL-17出現了逐漸降低趨勢，而IL-8維持在相同水平。表明陰道上皮細胞在受到白假絲酵母菌侵襲時，宿主免疫能在短時間內被激活，而且保護性因子出現的時間更早、維持時間更長。課題組推測，陰道內的免疫因子可能會影響白假絲酵母菌的Sap活性，而且也是臨床中只有部分VVC患者發展為RVVC的原因之一。但是，體外實驗存在各種限制，如細胞死亡等，今后可以使用動物模型進行深入研究。

本研究還顯示Sap活性高的白假絲酵母菌刺激陰道上皮產生的細胞因子更高，證實了Sap有誘發宿主免疫的作用，而且這種作用與Sap的高低呈正比。實驗引起一個假想：Sap高的白假絲酵母菌雖然侵襲力強，但是誘發的宿主免疫也強，因此更容易被宿主殺滅，從而不易復發。這個假想需要進一步實驗來確定。