miR-138調控TrkA-TRPV1信號通路對KOA模型大鼠軟骨損傷的影響

楊 砥，徐遠坤

膝骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)作為慢性退行性骨關節疾病，多發于中老年群體，以膝關節疼痛及活動障礙為主要表現[1]。流行病學調查顯示，KOA已成為全球公認的主要致殘原因，且近年來KOA發病呈年輕化發展趨勢，故有效預防KOA對人類健康具有重要裨益[2-3]。目前，KOA發病機制尚未完全闡明。有學者[4-5]指出，miR-138在KOA患者關節液中呈低表達，提示其可能參與KOA的發生發展，造成軟骨損傷，但其具體作用機制尚不明確。基于此，該文建立KOA模型，通過TrkA-TRPV1信號通路調控miR-138，探究miR-138對KOA大鼠軟骨損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 選取40只健康SD大鼠，體質量203～252(227.50±20.82)g，由科文斯醫藥研發(上海)有限公司提供，實驗動物許可證號：SYXK(滬)2021-0001。實驗動物處置嚴格遵守實驗動物管理與保護的有關規定，飼養環境恒溫(21.50±2.00)℃，相對濕度42%～50%左右，自由飲水攝食，12 h/12 h黑夜光照循環，以維持基礎狀態。

1.1.2主要試劑 TrkA一抗(兔來源，批號:ab76291)、二抗(抗兔，批號：ab150078)購自北京義翹神州科技股份有限公司；TRPV1(兔來源，批號：ab6166)購自武漢菲恩生物科技有限公司；antago miR-138、ago miR-138購自漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.1.3主要儀器 ELISA試劑盒購自上海美軒生物科技有限公司；酶標儀購自上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1建模及分組 將40只健康SD大鼠隨機分為正常組、模型組、沉默組、過表達組。正常組：給予大鼠尾部注射等劑量0.9%氯化鈉溶液處理；模型組：給予大鼠麻醉、作右膝關節內側入路，離斷摘除前后交叉韌帶、內側半月板，給予尾部注射等劑量0.9%氯化鈉溶液處理；沉默組：給予尾部注射30 mg/kg antago miR-138處理；過表達組：尾部注射30 mg/kg ago miR-138處理。同時各組給予腹腔注射8×104U青霉素(1 ml/kg)預防感染，連續注射1周。均連續給藥7 d。

1.2.2樣本采集及HE染色 于藥物干預7 d后，空氣栓塞法處死大鼠，抽取各組大鼠右膝關節關節液置于試管內，低溫、3 000 r/min(半徑：12 cm)離心10 min，分離上清液，-80 ℃超低溫冰箱內保存待檢。剪開膝關節囊，無菌操作分離股骨內踝關節軟骨組織，剪取部分軟骨組織制備勻漿液，將軟骨組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定，24 h后脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，依次經二甲苯、梯度乙醇水化后，蘇木精浸染5 min，鹽酸乙醇分色，自來水沖洗，1%伊紅染色2～3 min，脫水、透明、封片，光鏡進行觀察。

1.3 指標觀察

1.3.1行為學、軟骨組織學檢測

1.3.1.1行為學檢測 于藥物干預7 d后，應用改良Lecuesne MG膝關節評估法[6]對各組大鼠膝關節進行行為學評估，包括步態改變、關節腫脹、關節活動及疼痛刺激反應等。

1.3.1.2軟骨組織學檢測 使用顯微鏡對膝關節軟骨組織病理切片進行觀察，包括血管充血、炎細胞浸潤及軟骨細胞壞死等病理變化，應用Mankin評分[8]對各組大鼠軟骨組織形態學進行評估。0分：軟骨結構、軟骨細胞數量如常，潮線完整，基質染色正常；1分：軟骨細胞彌漫性分布，數量增多，軟骨表面存在不規則裂隙，出現多重潮線，基質染色減退；2分：軟骨細胞成簇生長，軟骨裂隙深達肌層，軟骨下血管浸潤肌層，基質染色明顯減退；3分：軟骨細胞顯著減少，軟骨裂隙深達輻射層，基質染色顯著減退；4分：軟骨裂隙深達鈣化層，基質染色完全消失；5分：軟骨層脫落。

1.3.2關節液中炎性因子水平檢測 利用雙抗體夾心法測定TNF-α、IL-1、IL-6，按照1 ∶2比例稀釋樣品；于每孔內加入100 μl已稀釋好的待測樣本和標準品，37 ℃恒溫孵育箱中濕育2 h；后以專用的洗滌液重復洗滌反應板，再加入1 ∶100稀釋的抗體工作液100 μl/孔，37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼清洗反應板4次后，在反應孔內加入腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6溶液100 μl/孔，置于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應孔內加入終止液100 μl/孔終止反應，在測定450 nm波長吸光度值，依據反應顏色深淺與待測指標水平成正比，計算TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.3.3軟骨組織骨代謝標志物陽性表達檢測 利用免疫組化法測定MMP-13、Col Ⅱ陽性表達，將石蠟切片脫水、PBS漂洗、3%過氧化氫與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原、修復、PBS漂洗后，加入一抗，常溫孵育2 h，PBS漂洗5 min，加入二抗，常溫孵育40 min，PBS漂洗5 min，DAB室溫顯色20～30 min，清洗、封片，光鏡下觀察細胞中基質金屬蛋白酶(metalloproteinase-13，MMP-13)、Ⅱ型膠原(collagen Ⅱ，Col Ⅱ)陽性表達細胞。根據顯色程度由淺至深記為0、1、2、3分，以細胞核著色記為陽性。每張片子以400×觀察，統計10個視野陽性細胞數目，計算陽性細胞率。陽性細胞率=陽性細胞數目/總細胞數×100%。

1.3.4RT-PCR檢測軟骨組織miR-138表達 microRNA提取分離試劑盒分離miR-138細胞總RNA，采用TaqMan microRNA反轉錄試劑盒進行microRNA逆轉錄，采用SYBR Premix ExTaq II kit進行定量PCR反應，采用2-ΔΔCt方法計算，內參為U6。設置反轉錄反應條件：25 ℃、10 min，40 ℃、60 min，85 ℃、5 min；設置擴增條件:94 ℃、20 s，72 ℃、30 s，60 ℃、30 s，35個循環，采用2-ΔΔCt方法計算出需要檢測的miR-138表達量。

1.3.5Western blot檢測法對各組大鼠TrkA、TRPV1表達 取大鼠待測軟骨組織按1 ∶5加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白，經電泳、轉膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1 ∶300)，孵育過夜。加入二抗(1 ∶5 000)，常溫孵育2 h，顯影、定影、沖洗、晾干，掃描膠片，采用Image J軟件分析TrkA、TRPV1表達，以β-actin為內參，目標蛋白水平=目標條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.4 統計學處理使用SPSS 19.0軟件處理數據，計量資料經levene法檢測具備方差齊性，shapiro-wilk檢驗符合正態分布，計量資料使用進行描述，組間行獨立樣本t檢驗；計數資料以%表示，組間比較進行χ2檢驗，P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 治療后各組大鼠右后膝關節軟骨切片HE染色圖正常組：軟骨細胞大小均一，排列整齊；模型組、沉默組：軟骨細胞增生，軟管表面細胞受損嚴重，表層軟骨細胞稀少；過表達組：軟骨細胞基本呈正常狀態，表層軟骨細胞增多。見圖1。

圖1 治療后各組大鼠右后膝關節軟骨切片HE染色圖 ×400A：正常組；B：模型組；C：沉默組；D：過表達組

2.2 各組大鼠行為學、軟骨組織學評估比較與正常組相比，模型組、沉默組、過表達組大鼠行為學、軟骨組織學評分升高(P<0.05)；與過表達組相比，模型組、沉默組大鼠行為學、軟骨組織學評分升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學、軟骨組織學評估比較分，n=10]

2.3 各組大鼠關節液中炎性因子水平比較與正常組相比，模型組、沉默組、過表達組大鼠TNF-α、IL-1、IL-6水平升高(P<0.05)；與過表達組相比，模型組、沉默組大鼠TNF-α、IL-1、IL-6水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠關節液中炎性因子水平比較

2.4 各組大鼠軟骨組織骨代謝標志物陽性表達比較與正常組相比，模型組、沉默組、過表達組大鼠MMP-13表達升高，Col Ⅱ表達降低(P<0.05)；與過表達組相比，模型組、沉默組大鼠MMP-13表達升高，Col Ⅱ表達降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠軟骨組織骨代謝標志物陽性表達比較

2.5 各組大鼠軟骨組織中TrkA、TRPV1、miR-138表達比較與正常組相比，模型組、沉默組、過表達組大鼠TrkA、TRPV1表達升高，miR-138表達降低(P<0.05)；與過表達組相比，模型組、沉默組大鼠TrkA、TRPV1表達升高，miR-138表達降低(P<0.05)。見表4、圖2。

圖2 各組大鼠軟骨組織中TrkA、TRPV1 Western blot圖A：正常組；B：模型組；C：沉默組；D：過表達組

表4 各組大鼠軟骨組織中TrkA、TRPV1、miR-138表達比較

3 討論

關節軟骨作為一種特殊的結締組織，其軟骨細胞轉化率較低。因此，軟骨損傷后自我修復能力較差。同時，軟骨細胞更新及代謝過程極為復雜，由多種細胞因子參與完成。研究[7]表明，軟骨細胞凋亡、細胞外基質降解是導致KOA軟骨降低的主要因素。

既往研究[8]表明，炎性因子變化通過調節、刺激各種酶活性對關節軟骨代謝造成直接影響。徐英杰 等[9]研究顯示，TNF-α、IL-1、IL-6在KOA患者關節液中呈異常高表達，通過對局部的刺激，造成關節軟骨退變加重。其中，TNF-α可參與免疫應答、介導炎癥反應等，在KOA模型大鼠關節液中呈異常高表達；而IL-6具有多種生物學活性，可增強TNF-α、IL-1效應，誘導合成多種急性時相反應蛋白。相關研究[10]證實，KOA動物模型關節液中可檢測到TNF-α、IL-1、IL-6，且含量明顯高于正常組，在通過干預后，TNF-α、IL-1、IL-6含量降低，提示通過下調關節液中炎性因子可達到治療KOA療效。本研究結果顯示，對KOA大鼠給予過表達miR-138干預后，軟組織病理損傷減輕，關節液內TNF-α、IL-1、IL-6水平降低，提示基于TrkA-TRPV1信號通路調控miR-138可改善KOA病理組織形態學，抑制關節炎性反應蔓延，證實miR-138對機體炎性反應具有良好的抑制作用。此研究結果為預防、治療KOA軟骨損傷提供重要參考依據。

MMPs作為軟骨基質內機制降解的主要蛋白酶，其中MMP-13作為降解基質內Col Ⅱ的主要膠原酶亞型，在骨性關節炎疾病的整個過程中發揮重要作用[11]。相關研究[12]證實，Col Ⅱ合成減少及降解加速與KOA發生發展呈正相關，且MMP-13通過裂解Col Ⅱ蛋白促進軟骨基質的降解，造成軟骨發生破壞和缺損。故通過檢測MPP-13、Col Ⅱ水平為軟骨退化情況評估提供重要參考。本研究結果顯示，基于TrkA-TRPV1信號通路對KOA大鼠進行過表達miR-138干預，大鼠軟骨組織內MPP-13表達降低、Col Ⅱ表達升高；表明過表達miR-138可抑制MPP-1合成增加，促進Col Ⅱ生產，減少軟骨細胞凋亡，緩解/減輕軟骨損傷；由此提示調控miR-138對改善細胞外基質降解、延緩關節軟骨退變具有重要意義。

相關研究指出，TrkA-TRPV1信號通路作為疼痛信號傳遞的關鍵通路，其信號阻斷對KOA疼痛抑制具有重要意義[13]。TrkA作為神經生長因子(NGF)的特異性受體可激活PI3K等降低TRPV1開放閾值，上調TRPV1表達產生反饋作用，是炎性因子釋放而降低痛閾；而TRPV1作為KOA治療的潛在靶點，TRPV1拮抗劑炎性關節疼痛緩解具有重要作用，但目前未見TrkA-TRPV1信號通路對miR-138調控的影響[14]。樊萍 等[15]研究指出，miR-138在參與KOA發生發展的同時與機體炎癥存在密切相關，TrkA-TRPV1信號通路與KOA大鼠炎癥反應密切相關，由此推測miR-138與TrkA-TRPV1信號通路間可能密切關聯。本研究結果顯示，通過對KOA大鼠給予過表達miR-138干預，TrkA、TRPV1表達降低，miR-138表達升高，提示上調miR-138對減輕軟骨損傷具有獨特意義，分析其原因或與抑制軟骨組織中TrkA-TRPV1信號通路激活相關。